荧光标记腐败菌PJ-9拮抗菌的筛选、鉴定与发酵条件优化研究

摘要

腐败是造成食物浪费的主要因素之一，食物腐败是由其内外环境及微生物共同作用的结果，引起食物腐败的微生物类型很多。由于食物腐败引起了巨大的浪费，在古代，人们通过盐泽的方式来保藏食物。随着科技的发展，人类用来保藏食物的方法越来越多，如低温冷藏、添加防腐剂以及高温杀菌。其中在大部分即食食物中通过添加防腐剂来防腐，但是防腐剂是一种化学试剂，本身对人体有害。因此，近年来微生物学家开始尝试用微生物制剂来抑制食物的腐败，微生物制剂是某些微生物产生的一些代谢产物，能抑制腐败菌的生长，而自身对人体无害。要得到这些代谢产物，必须要筛选一株合适的菌株。
　　本文是从腐败的泡椒凤爪中分离出来一株腐败菌Pseudomonas gessardii，并通过三亲结合将荧光蛋白GFP导入到该腐败菌中构建出一株工程菌PJ-9，以PJ-9作为被拮抗菌。
　　以腌豆角、腌白菜、酸菜及泡椒凤爪作为筛选材料，将四种材料的浸泡液经稀释分别在LB和MRS两种培养基上涂布。PJ-9菌经稀释后吸取适量的菌夜加入LB培养基中充分混合并倒平板。采用点种法，将四种材料培养出的菌用灭菌的牙签点种在混有PJ-9菌的LB平板上。根据是否产生押菌圈共筛选得到16株，其中从腌豆角中筛选出5株，腌白菜2株，酸菜6株，泡椒凤爪3株。通过进一步的复筛，然后根据抑菌圈的大小以及抑菌时间的长短，筛出一株拮抗菌作为研究的对象JK-3。扩增出JK-3的16s序列，并构建系统发育树，并通过生理生化实验确定为魏斯氏菌属，为G+，对PJ-9的平均抑菌半径为0.623cm。
　　通过单因素试验对牿抗菌株Weissella sp.JK-3的发酵条件进行了优化，根据实验结果表明Weissella sp.JK-3的最佳培养基组合为:以1％蔗糖为碳源，以1％酵母膏为氮源，无机盐为0.05％磷酸氢二钾;Weissella sp.JK-3的最佳培养条件:在30℃下培养，装液量为100ml/250ml，培养时间为44h，初始pH为6.0，接种量为5％。

目录

声明

摘要

符号和缩略语说明

前言

第一章 文献综述

1 食物的腐败及其菌类的组成

2 防止食物腐败的主要措施

2．1 低温贮藏法

2．2 高温贮藏法

2．3 干燥贮藏

2．4 盐腌及糖渍贮藏法

2．5 酸渍贮藏法

2．6 烟薰贮藏法

2．7 化学防腐剂贮藏法

2．8 生物防腐剂

3 荧光标记指示菌

4 拮抗菌的作用机理

4．1 竞争

4．2 产生抗菌物质

4．3 溶菌作用

5 拮抗菌的筛选方法

5．1 十字交叉划线法

5．2 点种法

5．3 平板扩散法

5．4 牛津杯法

6 微生物的分类鉴定

6．1 传统的分类鉴定

6．2 现代微生物学分类方法及系统发育进化树

7 拮抗菌发酵条件优化

7．1 培养基组分优化

7．2 培养条件优化

7．3 发酵条件优化的方法

第二章 拮抗菌的筛选及鉴定

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 拱试指示菌

1．3 仪器与试剂

1．4 筛选培养基

1．5 拮抗菌的初筛

1．6 拮抗菌的复筛

1．7 拮抗菌的鉴定

2 结果与分析

2．1 初筛的结果

2．1 拮抗菌的复筛

2．2 G4菌株的16S rDNA鉴定

3 讨论

4 结论

第三章 生理生化和抑菌能力鉴定

1 材料与方法

1．1 菌株、培养基及试剂

1．2 仪器

1．3 拮抗菌的鉴定

1．4 拮抗菌的抑菌能力

2 结果与分析

2．1 JK-3菌株的形态观察及生理生化特性

2．2 JK-3菌株的抑菌能力

3 讨论

4 结论

第四章 拮抗菌发酵条件的优化

1 材料与方法

1．1 种子液的制备

1．2 培养基

1．3 仪器与试剂

1．4 拮抗菌株培养基组分的优化

1．5 拮抗菌培养条件的优化

2 结果与分析

2．1 培养基组分的优化

2．2 培养条件的优化

3 讨论

4 本章小结

全文总结

参考文献

本文创新之处

附录

致谢