甘薯淀粉酶组织特异性及基因克隆和表达

摘要

通过液氮研磨提取甘薯愈伤组织和块根可溶性提取物，并采用非变性凝胶电泳和淀粉酶活性染色方法的研究发现，甘薯愈伤组织有4种迁移率不同的淀粉酶活性带，而块根只有1条淀粉酶活性带。以特异性底物支链淀粉对4种迁移率不同的淀粉酶进行类型鉴定，愈伤组织有2种α-淀粉酶和2种β-淀粉酶，而块根只有一种β-淀粉酶。淀粉酶抑制剂EDTA和β-巯基乙醇的敏感实验结果显示，块根β-淀粉酶对2种抑制剂都不敏感，而愈伤组织的淀粉酶则对2种抑制剂都敏感。 甘薯愈伤组织诱导及继代培养基组成成分都可能对淀粉酶基因的表达产生影响。不同激素对甘薯愈伤组织淀粉酶基因的表达都有重要作用，蔗糖的作用尤为重要。对甘薯愈伤组织进行不同时间的高温、低温、水涝、高温．水涝和低温。水涝处理后，对其可溶性提取物做非变性凝胶电泳和活性染色，发现它们对愈伤组织中3种主要淀粉酶基因的表达均具有不同程度的影响。在高温下的3种主要淀粉酶在前24h左右变化幅度相对较大，而低温对愈伤组织中的淀粉酶基因表达有增强作用，其中对β-淀粉酶基因B1的影响最为明显。甘薯愈伤组织高温-水涝总体上使3种淀粉酶活性呈下降趋势，其中淀粉酶A2和B1变化幅度相对较大。低温一水涝对3种淀粉酶活性的影响与高温-水涝的情况相似。 利用PCR技术从甘薯新大紫(lpomoea batatas Lam cv．Xindazi)基因组中扩增出预期大小的β-淀粉酶基因DNA片段(约3kb)。将该片段克隆至pMD-T载体，经酶切分析和序列测定显示，该片段长2914bp，限制酶BamHI，BglⅡ,EcoRV,Sad,SalI,XbaI,XhoI在片段中各有1个酶切位点，EcoRI有3个酶切位点，无HindⅢ，KpnI酶切位点。对克隆的β-淀粉酶基因进行序列分析然后与甘署另一晶种(lpomoea batatas Lam CV．Kokei No．14)的核苷酸相比，有99.1％的序列相同，但新大紫的β-淀粉酶基因共有8处碱基变异，集中在第Ⅵ外显子中。 碱基变异共造成5个氨基酸变化。甘薯新大紫β-淀粉酶与Kokei No.14甘薯β-淀粉酶的氨基酸序列比对结果显示，两者具有高达99.0％的同源性。 利用RT-PCR技术从甘薯新大紫(Ipomoea batatas Lam cv．Xindazi)块根总RNA中扩增出预期大小的β-淀粉酶cDNA片段(约1.5 kb)。然后将其插入pmDl8-T载体中，获得具有正确插入方向的重组质粒被命名为pMD-cAmy序列测定结果显示，该片段长1521bp，其开放阅读框(ORF)编码499个氨基酸残基，预测分子量55.97 kDa。克隆的β-淀粉酶cDNA与报道的甘薯另一品种KokeiNo.14的mRNA有99.5％的序列相同。重组子经IPTG诱导后，胞内可溶性提取物经凝胶电泳和活性染色，出现明显的淀粉酶活性带。重组子pMD-cAmy’在淀粉平板上形成明显的水解圈，说明甘薯β-淀粉酶cDNA不仅能在大肠杆菌中表达，而且能将有活性的β-淀粉酶分泌到胞外。对重组子pMD-cAmy和甘薯块根可溶性提取物的比较研究发现，大肠杆菌表达的β-淀粉酶与甘薯块根的B一淀粉酶除迁移率不同外，对淀粉酶活性抑制剂EDTA和β-巯基乙醇均不敏感。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图片目录,表格目录

第一章甘薯愈伤组织中的淀粉酶多型性研究

第二章温度和水分胁迫对甘薯愈伤组织淀粉酶基因表达的影响

第三章甘薯淀粉酶基因的克隆和分析

第四章甘薯块根淀粉酶cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

文献综述淀粉酶的研究进展

致谢

在读期间发表及待发表的论文情况

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