热带假丝酵母木糖还原酶基因（XYL1）的克隆、表达纯化及酶学性质研究

摘要

木糖是自然界第二丰富的碳水化合物(仅次于葡萄糖)。要有效利用木糖就要通过生物转化法，既微生物或者酶的催化将原料转化为更有附加价值的产物。许多微生物都能够将木糖作为一种碳源来利用。但是只有一小部分能够发酵木糖，并且副产物多，对高浓度代谢产物的耐受性差，都不利于进行大规模发酵。因此通过代谢工程获得更好的能够发酵木糖的工程菌是非常有吸引力的一条途径。例如能够发酵木糖的酵母工程菌，因为酵母更加适合大规模的发酵。天然酵母同化木糖的关键是木糖还原酶(EC 1.1.1.21)，它在辅酶NADH或NADPH存在的情况下能够将D-木糖还原成木糖醇。大部分木糖还原酶特异依赖NADPH，有一些则是需要利用NADH和NADPH，此外还有一些是偏好NADH的。尽管木糖还原酶不同的辅酶偏好性会影响木糖代谢工程菌的代谢流向，使其偏向于木糖醇积累或乙醇产生。但是想要通过基因改造获得能够更好的利用木糖的酵母工程菌，首先就要获得木糖转化率高的木糖还原酶，然后根据其辅酶的偏好性构建木糖代谢工程菌。在本实验室前期通过比较现有的一些酵母菌木糖醇发酵情况，已筛选出一株发酵纯木糖时木糖醇得率为47.30[％]，在优化发酵条件后得率70.91[％]的高产出发菌株热带假丝酵母(Candida tropicalis)AY92045的基础上，进一步研究取得如下成果： 1．C. tropicalis AY92045木糖还原酶酶活初步测定。通过比色法测定C．tropicalis AY92045木糖还原酶粗提液的比酶活，发现它能够利用2种辅酶，且NADH：NADPH活力比为0.715。而已报道来源于C.tropicalis IFO 0618的木糖还原酶只能利用NADPH为辅酶。为了确定该酶的辅酶偏好性，为下一步构建木糖代谢工程菌奠定基础，本试验从基因和蛋白水平上对其做进一步研究。 2．C. tropicalis XYLl基因的克隆及序列分析。根据已报道序列克隆了C tropicalisAY92045中XYLl基因，其大小为975bp。通过生物信息学分析，克隆所得XYLl基因与已报道的来源于C.tropicalis IFO 0618的木糖还原酶基因XYRA和XYRB的同源性相似性分别为98.5％和98.1％。其中XYRA与XYRB中的Pro4，Thr5，Ile6和Glu70分别被Val，Asn，Thr和Asp所代替。此外XYLl中的Thr29和Ala31与XYRA中的相同，而Ser249则与XYRB中的相同。 3．C. tropicalisXYLl基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化。为了更好的研究C．tropicalis AY92045木糖还原酶的功能以及验证其是否真的能够利用NADH，将克隆得到的木糖还原酶基因ORF片段插入到大肠杆菌表达载体pET-32a中，构建成重组质粒pET32a—XYLl并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。通过不同IPTG浓度，不同诱导时间和不同诱导温度进行小量表达，得到最优表达条件为：终浓度为0.3mmol/L的IPTG，37℃摇床培养4h。高效表达后，通过Ni亲和层析柱纯化出大量融合蛋白，其大小为57.5kDa。在酶切并再次纯化后，SDS-PAGE结果显示出一条带，重组木糖还原酶的比酶活为109.7μmol/min·mg。 4．C.tropicalls重组木糖还原酶酶动力学测定及分析。分别测定了纯化出的重组木糖还原酶的各项动力学参数，并研究其基本性质。该酶的最适pH在5.5左右，最适温度在40-50℃之间，其最佳底物是五碳糖。能够利用NADPH和NADH，但更偏好于NADPH,其KmNADPH为45.5μmol/L， VmaxNADPH为322.58μpmol/min·mg-protein；KmNADH为161.9μmol/L，VmaxNADH1.54μmol/min·mg-protein。通过对正向酶活和逆向酶活的测定发现它对木糖的催化效率相当高，且专一性好Kcat为14.4×10<'3>/min，Kcat/Km为457(mmol/L)/min；KmNADP<'+>为97μmol/L， Vmax为0.18μmol/min·mg-protein，未能测到Km木糖醇。 本实验获得一个以利用NADPH为主的，对木糖具有高催化效率的木糖还原酶，为下一步构建高产木糖醇的木糖代谢工程菌奠定基础

目录

前言

第一章C.tropicalis XYL1基因的克隆及序列分析

第二章C.tropicalis XYL1基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化

第三章热带假丝酵母木糖还原酶酶动力学测定及分析

结论

攻读硕士学位期间发表论文

声明

致谢

参考文献

综述 木糖发酵代谢工程研究进展