HnRNPB基因特异性SiRNA对肺癌细胞A549端粒酶逆转录酶影响的研究

摘要

目的:肺癌是当今世界上严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤，在癌症死亡中肺癌是男性和女性死亡的主要原因。现已证实肺癌细胞及肺癌组织HnRNPB<,1>表达明显增高。且HnRNPB<,1>可与端粒重复序列结合，并参与端粒酶介导的端粒长度的维持，提示HnRNPB<,1>可能通过调节端粒酶活性，维持端粒长度，使细胞持续分裂而永生化。hTERT是端粒酶的主要活性成分，其表达与肺癌端粒酶活性密切相关。本实验通过观察肺癌细胞A549HnRNPB<,1>基因沉默前后hTERT活性的变化，及其与肺癌细胞A549凋亡的关系，为探讨HnRNPB<,1>在肺癌发生发展中的分子机制提供实验依据。 方法:采用通过RNA干扰技术抑制HnRNPBl基因表达的肺癌细胞株A549为研究对象，并根据干扰的HnRNPB<,1>基因不同的靶序列，将实验组分为四组(A、B、C、D组)。对照组为转染空质粒的A549细胞(E组)和未转染任何质粒的A549细胞(F组)。用流式细胞计数观察HnRNPB<,1>SiRNA对肺癌细胞A549凋亡的影响；采用RT-PCR和免疫细胞化学的方法分别检测肺癌细胞A549 HnRNPB<,1>基因沉默前后hTERT的tuRNA和蛋白表达水平。 结果: (1)HnRNPB<,1>对肺癌细胞A549周期和凋亡的影响：HnRNPB<,1>SiRNA具有抑制肺癌细胞增殖、促进凋亡的作用，实验组凋亡率较对照组明显增加，分别为A组(19.2±1.25)％、B组(23.4±3.12)％、C组(24.0±2.28)％、D组(33.5±2.49)％，而对照组凋亡率仅(8.7±1.86)％、(9.1±2.21)％。且实验组S期细胞分别为A组(27.0±2.97)％、B组(25.4±3.65)％、C组(24.2±4.12)％、D组(19.6±3.56)％，较对照组明显减少； (2)HnRNPBl对肺癌细胞A549 HnRNPBl mRNA的影响：RT-RCR结果显示：HnRNPBl SiRNA能够降低肺癌细胞A549 HnRNPB mRNA的表达，在实验组HnRNPB mRNA的抑制率分别为：77.69％、74.37％、75.65％和83.04％； (3)HnRNPBl对肺癌细胞A549 hTERT mRNA表达的影响：RT-RCR结果显示：HnRNPBl SiRNA能够降低肺癌细胞A549 hTERTmRNA的表达，在实验组hTERT mRNA的抑制率分别为88.67％、90.67％、91.33％、86.67％，而空质粒组hTERT mRNA表达未受抑制； (4)HnRNPB<,1>对肺癌细胞A549 hTERT蛋白表达水平的影响：免疫细胞化学结果显示，各实验组hTERT蛋白阳性表达率较对照组明显降低，有统计学意义，提示HnRNPB<,1> SiRNA能够降低hTERT蛋白的表达； (5)相关性分析提示HnRNP B<,1> mRNA的表达和hTERT mRNA的表达成明显的正相关，而HnRNP B<,1> mRNA和hTERT mRNA的表达与细胞凋亡率成负相关。 结论: (1)HnRNPB<,1> SiRNA能特异性抑制肺癌A549细胞HnRNP Bl基因表达； (2)HnRNPB<,1> SiRNA能够促进肺癌细胞A549凋亡，抑制其增殖； (3)HnRNPB<,1> SiRNA能够抑制A549细胞hTERT mRNA及蛋白水平的表达； (4)HnRNP B<,1>可通过调节hTERT活性参与肺癌细胞的增殖和凋亡的调节。

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摘要

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材料与方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

文献综述 不均一核糖核蛋白B1在肺癌发生机制中的研究进展

致 谢