HnRNPB1特异性siRNA真核表达载体的构建及其对肺癌细胞增殖作用的研究

摘要

目的：构建HnRNPB1特异性的siRNA真核细胞表达载体并转染人肺癌细胞株A549，了解重组载体对A549细胞HnRNPB1基因的干扰效果以及对其生长增殖、周期凋亡的影响，为进一步探讨HnRNPB1基因在肺癌发生发展中的作用，RNA干扰(RNAi)分子靶向基因治疗肺癌提供一种新的手段和理论基础。 方法： 1.利用计算机辅助设计软件，根据GenBank数据库提供的HnRNPB1基因核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，在HnRNPB1序列中选取AAAACTTTAGAAACTGTTCCT(7-27)、AACAGTTCCGTAAGCTCTTTA(52--72)、AAGCTGTITGTTGGCGGAATT(336--356)、AAAGGCTTTGTCTAGACAAGA(554—574)4段作为靶序列选择设计4对双链小干扰：RNA(small interfering RNA,siRNA)，再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs，shRNA)的4对DNA序列，并与psiRNA质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体，得到HnRNPB1特异性siRNA的4对重组质粒，分别命名为A，B，C，D，经PCR和DNA测序进行鉴定。 2.采用脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染A549细胞24小时，RT-PCR检测HnRNPB1 mRNA的表达。在瞬时转染的基础上，利用该载体带有的药物抗性筛选系统进行稳定转染，筛选出阳性A549细胞克隆，以荧光定量RT-PCR检测不同时间点转染前后HnRNPB1 mRNA表达的变化、western blot检测转染前后HnRNPB1蛋白表达的变化。 3.采用：MTT检测重组质粒A,B,C,D转染A549细胞后细胞增殖的变化，通过细胞生长曲线观察转染前后细胞生物学行为的变化。 4.以流式细胞仪检测重组质粒.A,B,C,D转染A549细胞后细胞周期及凋亡的变化。 结果： 1.利用PCR分析，DNA测序证实HnRNPB1特异性、siRNA表达载体A,B,C,D已成功构建。 2.重组质粒A,B,C,D及空质粒E通过脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染A549细胞24小时，采用RT-PCR检测HnRNPB1 mRNA的表达，结果显示：未转染组F、空质粒E组HnRNPB1的mRNA表达与转染前比较均无明显变化，而A,B,C,D组的HnRNPB1 mRNA表达明显下调，分别下降了46％、65％、58％、73％(p<0.05)。 3.重组质粒A,B,C,D稳定转染A549细胞，抗性克隆形成后1周，它们对HnRNPB1 mRNA抑制率分别为77.69％,74.37％,75.65％,83.04％，HnRNPB1蛋白表达有不同程度的降低，而空质粒E在转染前后无明显变化。 4.重组质粒A,D稳定转染A549细胞抗性克隆形成后4周，对HnRNPB1 mRNA抑制率分别为65.8％,70.3％，HnRNPB1蛋白表达仍有明显降低，而空质粒E在转染前后仍无明显变化。 5.重组质粒A,D转染A549细胞抗性克隆形成后6周，对HnRNPB1mRNA抑制率分别为41.06％,49.88％，HnRNPB1蛋白的表达与空质粒E转染A549细胞后HnRNPB1蛋白的表达与转染前无明显变化。 6.重组质粒A,B,C,D能不同程度抑制A549细胞的增殖。 7.重组质粒A,B,C,D转染A549细胞抗性克隆形成后1周，与未转染组相比，G1期细胞比例明显增多，S期细胞比例明显降低；FCM检测示细胞发生了明显的凋亡，凋亡率分别为：17.8％、19.4％、16.6％、27.5％。重组质粒A,D转染A549细胞抗性克隆形成后4周、6周G1期细胞比例逐渐减少，S期细胞比例逐渐增多，细胞的凋亡率分别为：11.2％、15.9％；6.7％、4.9％，随着时间的延长，凋亡的效果降低。重组质粒对细A549胞HnRNPBl基因的抑制作用可以维持4周以上。 8.空表达载体E转染A549细胞后在任何时间点对HnRNPB1基因的mRNA、蛋白质的表达和细胞的周期、凋亡及增殖均都无明显影响。 结论： (1)HnRNPB1 siRNA表达载体能特异、高效地抑制肺癌细胞A549HnRNPB1基因的表达，作用时间至少可维持抗性克隆形成后4周；(2)可调控肺癌细胞周期、凋亡，抑制肺癌细胞的增殖，有望成为肺癌基因治疗的合理策略之一。

目录

论文说明：英语缩略词表

声明

前 言

第一部分HnRNPB1基因特异性siRNA真核表达载体的构建

材料及方法

结 果

讨 论

结论

参考文献

第二部分HnRNP B1 siRNA对肺癌A549细胞增殖作用的研究

材料及方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

全文小结

论文主要创新点

后续思考

博士期间发表论文

攻读博士学位期间获得的奖励

综述一：RNA干扰在肿瘤研究中的进展

综述二：HnRNPB1与肺癌的研究进展

致 谢