人乳头瘤病毒的基因分型及HPV16亚型L1、E6和E7基因的克隆和序列分析

摘要

人乳头瘤病毒是一类特异感染人皮肤、粘膜的双链环状DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，其分子量大约为8000bp。目前已有100多种HPV亚型被鉴定，其中约40余种与人类生殖器皮肤黏膜病变有关．根据其对生殖系统的致癌性，可将其分为低危型和高危型，前者包括HPV6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81等，以HPV6,11最为常见，主要引起尖锐湿疣等良性病变；后者包括HPV16，18,31，33,35,39,45,51，52,56,58,59,68,72,82等，其中以HPV16,18最为常见，常引起恶性病变，如宫颈癌．由于HPV的致病性与其亚型密切相关，所以对其进行检测和分型对于临床诊断具有重要意义． 另外，对HPV16亚型HPV病毒E6，E7，L1基因突变的研究表明特定位点的突变会使病毒更易诱导产生癌变及增大再次感染或从宿主免疫系统逃逸的机会。如HPV16型E6蛋白83位的亮氨酸残基变为缬氨酸(碱基突变T350G)的突变株在瑞典妇女宫颈癌组织中出现的比例远大于野生型，一些研究认为在部分人群中，该突变与组织癌变进程相关。不同的变异导致的氨基酸的变化可影响宿主对病毒的免疫应答，进而与细胞恶性转化的危险性相关。因此对宫颈癌组织中HPV16亚型基因组突变的研究对宫颈癌疫苗研制策略及HPV致癌机理的研究也具有重要意义。目的1．探讨各种妇科疾病与人乳头瘤病毒感染的关系，建立不同妇科疾病和不同年龄段妇女人乳头瘤病毒感染的流行病学资料库。 2．了解中国西南地区HPV16亚型基因的一级结构特点，为临床诊断、治疗由HPV16亚型感染引起的疾病特别是宫颈癌提供理论依据。 方法 1.应用反向点杂交技术分别对疾病组1512例病人标本和正常组500例标本进行HPV检测，所得数据用SPSS13.0软件包进行统计分析。 2.收集宫颈癌组织标本，针对HPV16亚型分别设计L1、E6和E7基因特异性引物，用PCR方法从宫颈癌组织中获得各基因的全长序列，并构建克隆载体pMD18-T，进行序列分析，同时分别以L1、E6和E7基因序列进行进化分析。结果1.正常组500例标本中，阳性标本101例，感染率为20.2％；疾病组1512例标本中，阳性标本523例，感染率为34.6％，其中双重感染82例，占阳性标本的15.7％，多重感染34例，占阳性标本的6.5％，而高危感染340例，感染率为22.5％，占阳性标本的65.0％，其中单纯HPV16亚型感染155例，占所有阳性标本的29.6％；不同年龄段、不同性生活史、不同妇科疾病以及不同首次性生活年龄的HPV感染检出率都有显著性差异。 2.与德国标准株相比，四个标本中总共发现20个突变位点，其中8个为四个标本所共有：131(G-A)(Gly-Arg)、178(T-G)(Asp-Glu)、350(G-T)(Val-Leu)、647(A-G)(Asn-Asp)、846(T-C)(同义突变)、L1基因第966(C-T)(同义突变)、L1基因第1302(C-T)(同义突变)和L1基因第1434(A-G)(同义突变)。结论1.正常组和疾病组的HPV感染率有显著性差异(x<'2>=36.37，P<0.01)。在HPV感染的的普查当中可以有重点的选择高危人群，这样更加有针对性，从而大大降低普查成本。 2.在所检测的23种亚型种，高危型HPV16亚型所占比例最高，提示我们HPV16亚型对于宫颈疾病的发生具有重要的作用，需要我们对其进行深入的研究。 3.与标准序列比较，中国成渝地区HPV16亚型L1、E6和E7基因存在一定范围的变异，提示我们，在预防治疗成渝地区妇女宫颈癌病人以及研制开发针对成渝地区预防宫颈癌的HPV疫苗时，需要注意这些位点的变异，特别是一些引起氨基酸变异的位点。

目录

声明

摘要

前言

第一部分临床标本中人乳头瘤病毒的基因分型

1材料

1.1样本采集

1.2仪器和试剂

2实验原理

3实验方法

3.1临床样品HPV DNA获取和处理。

3.2 HPV DNA片段的PCR扩增

3.3杂交和显色

3.4结果判定

3.5统计方法

4结果

4.1正常组和疾病组HPV感染的比较以及HPV感染与相关疾病的关系

4.2 HPV感染与年龄的关系

4.3首次性生活年龄以及怀孕次数与HPV感染的关系

5 讨论

5.1 HPV感染与相关妇科疾病的关系

5.2 HPV感染与年龄的关系

5.3首次性生活年龄以及怀孕次数与HPV感染的关系

第二部分利用悬浮点阵技术对反向膜杂交技术进行评价

1材料

2原理

3方法

3.1标本DNA提取

3.2 PCR扩增

3.3探针设计

3.4杂交

4结果与分析

4.1液相芯片检测结果

4.2反向点杂交检测结果

4.3两种方法检测结果的比较

5讨论

第三部分人乳头瘤病毒16亚型L1、E6和E7基因的分离克隆和序列分析

1材料

1.1实验标本

1.2载体和菌株

1.3工具酶及生化试剂

1.4试剂配方

2方法

2.1宫颈癌组织DNA的提取

2.2型别鉴定

2.3引物的设计与合成

2.4 PCR扩增HPV16亚型E6、E7和L1基因

2.5扩增产物的观察与回收

2.6利用pMD18-T载体克隆所需基因片段

3结果

3.1反向膜杂交结果

3.2宫颈癌组织中HPV16 E6、E7、L1 ORFs DNA片段的扩增

3.3 pMD18-T/HPV16 E6、E7、L1 ORFs重组质粒的构建

3.4 HPV16致癌基因E6、E7以及衣壳蛋白决定基因L1的序列变异分析

3.5系统进化分析

4讨论

参考文献

文献综述 人乳头瘤病毒的研究进展

1人乳头瘤病毒的生物学简介

2 HPV检测方法的研究进展

参考文献

在读期间发表论文及待发表的论文

致谢