烟草叶绿体-核共转化载体的构建和转化烟草初步研究

摘要

植物转基因技术发展至今，已经有了成熟的方法和有效的转基因植株筛选、再生措施。目前转基因植物中普遍应用的选择标记基因是编码抗生素抗性的基因。选择标记基因是为方便鉴定和筛选而加入的，对于成功筛选转基因植株起到了很有效的作用。但携带选择标记的转基因植物对人体和环境却存在潜在的危害，这也是转基因作物应用到生产上的阻碍因素之一；另外，标记基因的存在会阻碍用同样的标记基因进行多次转化选择；去除标记基因也可以减少目的基因沉默几率。因此，关于转基因植物中选择标记基因特别是抗性标记基因的控制的研究迅速开展起来，到今天为止已经有了一系列应对的生物安全策略，其中可以通过共转化的的方法在得到转基因植物后将标记基因删除，到目前为止，都是通过筛选基因与目的基因共转化进植物核基因组中，还没有关于叶绿体一核基因组共转化的报道。 本实验即立足于转基因植物的生物安全控制方法模式韵建立，本文通过构建叶绿体一核共转化载体，转化模式植物烟草，探讨叶绿体一核共转化模式用于筛选无标记基因的转基因植物的可能性。 首先在质粒pICF6061的框架上加入CaMV 35S Pro-mgfp4-NOS ter框，初步构建了可用于烟草叶绿体-核基因组共转化的载体pICF6061.G。再从百日红烟草DNA中通过PCR的方法扩增出一段烟草核基质结合区序列，经过序列测定和NCBI和DNAman比对，确定为烟草MAR序列Rb7,将Rb7顺式连接入叶绿体转化载体pICF6061．G的mgfp4框两侧，构建了可用于烟草的叶绿体一核转化载体pICF6061.G.R。该载体含可在叶绿体基因组中表达的卡那霉素筛选标记基因aphA-6,具有烟草叶绿体基因组16S启动子；含有可在核基因组中表达的核标记基因绿色荧光蛋白基因mgfp4, 具有烟草核基因组35S启动子；在aphA-6和mgfp4框两侧具有两段烟草叶绿体同源片段trnN和trnR,可使目的基因通过同源重组的方式定点整合到烟草叶绿体基因组中；MAR序列Rb7置于外源基因两端可以减少外源基因在不同转化体间表达水平的差异，提高pICF6061.G.R中mgfp4的表达水平。 将构建的叶绿体一核转化载体pICF6061.G.R用基因枪的方法，通过金粉子弹轰击烟草3月龄无菌苗叶片，轰击后的叶片切成小块后在MS再生培养基上经过400mg/L卡那霉素筛选，叶片小块先后长出愈伤，分化出不定芽、丛生芽,将小芽切下转入无激素MS培养基上生根，其间保持抗生素筛选压，RT-PCR表明基因aphA-6已经整合进叶绿体基因组中并已表达。用荧光显微镜观察转卡那霉素的再生烟草其绿色荧光蛋白表达情况，发现叶片细胞有嵌合的绿色荧光，RT-PCR验证表明mgfp4得到表达。 实验证明采用一个载体，用基因枪介导方法进行烟草叶绿体与核基因组的共转化是可能的，可以以此为依据进行进一步实验来研究能否通过该途径经过一次转化，一次与野生型母本杂交以获得无标记基因的转基因植物。另外，不排除基因从叶绿体基因组转移至核基因组的可能性。

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文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

声明

第一章叶绿体-核转化载体的构建

引言

1材料与方法

1.1实验材料、试剂及仪器

1.2实验方法

1.3载体构建

2结果和讨论

2.1 MAR序列Rb7的扩增及测序鉴定

2.2 DNA片段末端的平滑化与载体的去磷酸化

2.3载体构建

2.4讨论

参考文献

第二章基因枪转化烟草及转基因烟草的筛选鉴定

引言

1材料与方法

1.1实验材料、试剂及仪器

1.2基因枪转化

1.3轰击后培养及筛选

1.4绿色荧光蛋白的观察

1.5 RT-PCR验证

2结果与分析

2.1转基因烟草再生

2.2绿色荧光蛋白表达

2.3讨论

参考文献

转基因植物中选择标记基因的生物安全控制策略研究综述

在读期间科研成果简介

致谢