Hcy对人血管平滑肌细胞MTHFR基因启动子甲基化修饰和mRNA表达的影响及叶酸的拮抗作用

摘要

研究背景与目的：同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)为非蛋白质组成氨基酸，体内不能合成，其生理作用主要是参与体内一碳单位的代谢，目前公认，体内Hcy浓度升高是导致动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)的独立危险因素之一。本研究的主要目的是希望通过以临床相关的高Hcy浓度处理人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cells，HVSMCs)，反作用于代谢Hcy的MTHFR基因，检测高Hcy对其启动子甲基化修饰及其mRNA表达的影响，以了解高Hey是否通过对MTHFR基因启动子的异常甲基化修饰产生正反馈的损伤效应，即高Hcy→MTHFR基因启动子异常甲基化_MTHFR mRNA表达↓→MTHFR活性↓→Hcy进一步↑，从而促进动脉粥样硬化进行性发展。并同时探讨叶酸可能的干预作用，为As的预防和治疗提供新的思路和启示。 材料和方法：本实验人血管平滑肌细胞取自正常脐动脉，采用组织贴块法获得，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液于37℃的CO<,2>孵育箱内培养，选用3～7代细胞作为实验用细胞。分为对照组：正常生长的平滑肌细胞；Hey处理组：不同浓度：Hcy(0,30，100，200，500,10001μmol/L)分别作用细胞24h，48h,72h；叶酸处理组：100μmol/L Hcy+FA(1001μmol/L)，500μmol/LHey+FA(100μmol/L)，FA(100μmol/L)，作用细胞72h。各组每24h更换一次培养液，并添加新鲜配制的干预液。提取各组细胞基因组DNA，以巢式降落甲基特异性PCR(MS-PCR)分析MTHFR启动子区域甲基化状态。提取各组细胞总RNA，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定MTHFR mRNA的表达水平。数据采用x±s表示，应用SPSS13.0软件，采用单因素方差分析方法进行统计学分析，P<0.05差异有统计学意义。 结果：不同浓度和不同时间Hcy干预后，HVSMCs MTHFR基因启动子区域出现去甲基化，甲基化水平明显降低，RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达增加，其mRNA表达水平在100μmol/LHcy时达到高峰，直至极高浓度Hcy时仍刺激MTHFR mRNA呈高表达，与对照组相比有显著差异。此外，100μmol/L Hcy呈时间依赖关系促VSMCs MTHFR mRNA表达，72h达高峰；而叶酸能明显抑制Hcy所引起的MTHFR基因启动子区域去甲基化，RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达亦有所降低，与Hcy组相比差异有统计学意义，对正常细胞无显著差异。 结论：综合上述结果，本文显示，高Hcy可通过引起DNA甲基化修饰的改变，而改变MTHFR基因的表达，叶酸可一定程度的拮抗这种效应。Hcy诱导催化其自身向甲硫氨酸转化的关键酶MTHFR基因DNA去甲基化和mRNA明显高表达，显然有助于降低过高的Hcy，这无疑是一种代偿机制，而非高Hcy的损伤效应；这提示环境因素对基因甲基化修饰的影响可以是损伤的、致病的，但亦可能是代偿性反应。由于干预DNA甲基化修饰的治疗策略已经成为一个重要的研究领域，因此，阐明在同一影响因素下，何以某些基因去甲基化，而另一些基因高甲基化?哪些DNA甲基化修饰的改变是致病的，哪些是代偿性的?对于合理的制定干预策略无疑具有重要的理论和实践意义。

目录

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材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，同型半胱氨酸与动脉粥样硬化的相关性

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