手掌参中赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白的表达、纯化及鉴定

摘要

在前期筛选手掌参cDNA文库获得编码赤酶酸诱导的富含半胱氨酸蛋白的基因gcgasa基础上，研究基因本身的信号肽对gcgasa基因原核表达的影响。
　　方法：设计带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物，分别对gcgasa基因编码区全长(gcgasa)及信号肽缺失的cDNA片段(?gcgasa)进行PCR扩增，将目标片段克隆入原核表达载体pET-32(a)，构建重组质粒pET-32(a)/gcgasa、pET-32(a)/?gcgasa。经测序鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达融合蛋白，采用SDS-PAGE及 Western-blotting鉴定外源蛋白的表达，并通过电镜超薄切片技术检测包涵体在细胞内的定位。对于水溶性蛋白，进一步采用亲合层析手段进行初步纯化。
　　结果:测序鉴定外源基因成功插入表达载体。SDS-PAGE及Western-blotting结果表明：含有信号肽的外源基因在大肠杆菌中以不可溶包涵体形式存在，而信号肽缺失的片段主要以可溶形式表达。细胞超薄切片的透射电镜结果显示：pET-32(a)/gcgasa中的包涵体主要出现在周质空间，而pET-32(a)/Δgcgasa重组质粒表达蛋白主要定位在细胞质中。可溶性产物经Ni-NTA柱及凝胶过滤后可获得纯度较高的蛋白。
　　结论：信号肽缺失的?gcgasa能在大肠杆菌中高效表达，其表达产物可溶，并取得了一定纯度和浓度的目标蛋白，这为进一步研究GASA的结构和功能奠定了基础。

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第一章 绪 论

1.1本课题研究意义

1.2 国内外研究概况

1.3 本课题的研究内容

第二章 重组质粒的构建及融合蛋白的表达和纯化

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

第三章 讨论与展望

3.1 实验讨论

3.2 实验展望

致谢

参考文献

攻硕期间取得的研究成果