大鼠三叉神经脊束核和海马星形胶质细胞对咬合创伤的反应

摘要

近年来的研究显示，咬合创伤后不仅能引起牙周、牙髓等口颌面组织内相关物质的变化，还造成初级感觉神经元传入功能和敏感化的改变。目前对咬合创伤的神经传导研究，侧重于对神经元功能的研究。神经系统由胶质细胞和神经元组成，传统的观念认为，神经元是神经系统的基本功能单位，伤害性刺激的感受、传导及调节，都是由神经元完成的，而胶质细胞虽然在神经组织中的数量远远超过神经细胞，仅起营养和支持的作用，不对刺激起反应。最近的研究显示，胶质细胞不仅对伤害性刺激起反应，而且在其发生、发展过程中起重要的调节作用。 胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的特异性标记物，星形胶质细胞被外界伤害性刺激激活后，可引起GFAP阳性产物的增加，激活后的星形胶质细胞可以释放IL-1、IL-6等细胞因子以及兴奋性氨基酸、花生四烯酸、白细胞三烯等神经活性物质，共同参与和调节伤害性刺激的传导。本实验研究了咬合创伤下星形胶质细胞的变化，以探讨星形胶质细胞是否与神经元一起参与了咬合创伤所致口颌面痛的传导及调控过程，以及在此过程中与神经元的关系。 镜像痛(mirrorpain)和区域外痛(extra-territorialpain)是以往两种难以解释的疼痛现象。镜像痛是指身体一侧受损后导致对侧正常部位产生疼痛感。以往猜测认为它可能与脊髓内和脑至脊髓的神经元回路有关。区域外疼痛是指组织发生损伤时，除该神经的支配区有疼痛感外，与之邻近的正常神经支配区也常常感到疼痛。现阶段研究发现，这两种疼痛现象的本质是胶质细胞的激活以及激活后释放的前炎性细胞因子的原因。咬合创伤后不仅能引起创伤侧牙周、牙髓组织的变化，还引起创伤周围正常组织以及非创伤侧的疼痛，以往推测是由于单侧咬合创伤使感觉中枢敏化，神经元感受野扩大，使非创伤侧对伤害性刺激反应敏感。那么在咬合创伤中伤害感受野扩大的现象是否也与星形胶质细胞激活以及释放的细胞因子有关呢?本实验观察了咬合创伤后星形胶质细胞及细胞因子的变化情况，以期探讨咬合创伤后伤害野扩大及非创伤侧疼痛的可能机制。 海马是神经系统的高级核团，边缘系统的重要组成部分，与其它脑区有着广泛的纤维联系，是学习、记忆、行为和情绪的神经解剖基础，大量研究证实，应激能引起动物海马区结构和神经递质、神经活性物质等的变化。近年国外一些研究发现，海马在痛觉的调制中也起着非常重要的作用。既往研究证实，咬合创伤能导致口颌面慢性疼痛，那么在此过程中，是否也引起海马区的变化呢?实验前期，我们观察到咬合创伤引起了实验动物一些行为学改变，如反应敏感性下降、迟钝等等。这些行为变化是否与海马区变化有关联呢?因此，本实验观察了咬合创伤后海马区GFAP的变化，探讨海马在咬合创伤中的作用。 针对上述研究现状，我们设计本实验：第一部分：咬合创伤对大鼠行为学及体重变化的影响目的：建立咬合创伤动物模型，观察咬合创伤对大鼠行为学及体重变化的影响。 方法：大鼠麻醉后，在其左上颌第一磨牙上粘结方丝，将咬合抬高0.5-0.8mm，造成左侧磨牙早接触的创伤咬合。每日于固定时间检查粘结物固位情况，观察大鼠行为学变化，每周称量体重，计算体重增长率；对照组大鼠也做同样检查。 结果：(1)口内检查见1月组大鼠实验牙验面明显磨损，低于邻牙。x线片显示，咬合创伤1月组大鼠下颌受创伤牙牙周膜增宽，牙槽骨有少量吸收。 (2)咬合创伤引起大鼠行为学变化：建立创伤模型后第1周，大鼠性情急躁，攻击性强，捉拿时反应较对照组激烈，2周后创伤组大鼠渐呆滞，活动量较对照组明显减少，反应迟钝。 (3)咬合创伤对生长发育及体重的影响：创伤1月组大鼠被毛杂乱，光泽度差，色略黄，而对照组大鼠被毛顺滑，有光泽。创伤组大鼠体重平均增长率低于对照组。 结论：咬合创伤后大鼠发生行为学变化，反应迟钝，敏感性下降；出现被毛杂乱，光泽度差等营养缺乏症表现；平均体重增长率低于对照组。提示咬合创伤后可引起大鼠行为学改变。 第二部分：星形胶质细胞对咬合创伤的反应及其与神经元的关系目的：观察咬合创伤后Sp5C中GFAP的合成及释放情况，了解细胞因子在咬合创伤中的变化情况。探讨星形胶质细胞在咬合创伤中的作用及与神经元的关系。 方法：制备大鼠咬合创伤模型，采用免疫荧光方法，观察三叉神经脊束核尾侧亚核(Sp5C)中GFAP、c-fos免疫阳性细胞的改变，用RT-PCR方法检测GFAP、IL-1、TNFα、nNosmRNA表达的变化。 结果：(1)咬合创伤后1d，实验侧Sp5C内GFAP阳性细胞面积减少，免疫荧光强度也略有减弱；3d时GFAP阳性面积开始增加，免疫荧光强度也增强；7d时达到高峰；咬合创伤14d组GFAP阳性反应产物开始减少，4w时接近对照组水平。咬合创伤3d起，对侧Sp5C中GFAP阳性结构面积也开始增加，但低于实验侧；14d组对侧GFAP阳性反应面积逐渐减少。 (2)咬合创伤后7d，实验侧Sp5C内c-fos阳性细胞数增加，14d时达高峰，以后开始减少，4w组接近对照组水平。 (3)咬合创伤后1d，GFAP、IL-1、TNFα、nNosmRNA表达即上调，3d时，GFAP、IL-1、TNFαmRNA上调明显，达到峰值，7d组开始下降。nNosmRNA于14d时上调达峰值，4w时接近正常对照组。结论：咬合创伤后，Sp5C中GFAP的合成、表达及释放增加，出现高峰时间早于c-fos阳性产物。IL-1、TNFα、nNosmRNA表达增强，提示咬合创伤激活了星形胶质细胞，激活的星形胶质细胞有可能将信息传递给神经元，同时释放大量细胞因子，共同调节咬合创伤过程。 第三部分：咬合创伤后大鼠海马区星形胶质细胞的变化目的：观察咬合创伤后，大鼠海马各区星形胶质细胞的形态及数量变化，探讨海马结构在咬合创伤过程中的作用。 方法：采用免疫组化及免疫荧光染色方法，观察咬合创伤后海马内星形胶质细胞的变化及其各区的分布情况。 结果：(1)正常大鼠海马结构内可见少量星形胶质细胞，呈星形，胞核边缘可见细长的突起，咬合创伤后，星形胶质细胞形态改变，胞核肥大，突起增粗弯曲。 (2)咬合创伤后1d、3d组，海马GFAP阳性细胞数与对照组相比无明显差异；创伤后7d，海马区GFAP阳性细胞数开始增加，但与对照组相比并无统计学意义；14d时，海马内GFAP阳性细胞数继续增加，主要分布在CA1及CA3区；4w时，GFAP阳性细胞数显著增加，达高峰，主要分布在CA1及CA3区，但以CA3区为主；5w时，海马内GFAP阳性细胞数开始减少，与创伤2w组密度相近，仍高于正常水平。咬合创伤后海马内GFAP阳性细胞数的增加依次为4w＞2w、5w＞7d＞3d＞1d。 结论：咬合创伤后，海马区星形胶质细胞发生了形态及功能学改变，GFAP阳性星形胶质细胞数量增加，提示海马区参与了咬合创伤的调节过程，海马CA1区、CA3区，尤其是CA3区与咬合创伤所致口颌面痛关系密切。大鼠咬合创伤后行为学特征与海马内GFAP阳性细胞的一致性变化规律是否提示海马结构在调控咬合创伤后痛情绪的变化方面发挥作用有待深入研究探讨。

目录

英文缩略词表

文献回顾

1.咬合创伤研究进展

2.口颌面疼痛的传导途径

3.咬合创伤可引起致痛物质及神经生化的改变

4.海马与疼痛的关系

5.星形胶质细胞与疼痛的关系及其与神经元的相互作用

6.神经元与胶质细胞的关系

7.星形胶质细胞在疼痛传导中的作用

8.胶质细胞参与疼痛调节的机制

9.口颌面疾病中星形胶质细胞的变化;

参考文献

第一部分咬合创伤大鼠行为学及体重变化

第二部分星形胶质细胞对咬合创伤的反应及其与神经元的关系

实验一大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核星形胶质细胞对咬合创伤的反应

实验二咬合创伤诱导三叉神经脊束核尾侧亚核细胞因子及一氧化氮合酶的变化

实验三咬合创伤后大鼠Sp5C内c-fos的变化

第三部分大鼠咬合创伤后海马区GFAP的变化

参考文献

附图

致谢