老年大鼠肾脏缺血/再灌注损伤诱导肾小管上皮细胞凋亡的变化特点及机制研究

摘要

肾脏缺血是急性肾功能衰竭的常见原因，老年人对其易感性增加，但机制尚不清楚。肾缺血导致急性肾衰的原因是缺血/再灌注损伤，肾小管上皮细胞凋亡是其重要发生机制之一。机体衰老进程中也存在着细胞凋亡的失调，在生理状态下肾小管上皮细胞凋亡随增龄增加。但肾脏缺血/再灌注损伤时老年肾小管上皮细胞凋亡是否也更加明显，以及细胞凋亡在老年缺血性急性肾衰中的作用尚无报道。目的：观察老年大鼠肾脏缺血/再灌注损伤诱导肾小管上皮细胞凋亡的变化特点，及其与肾功能损伤和肾脏病理改变的关系，探讨细胞凋亡在老年缺血性急性肾衰中的作用；通过对caspase依赖的内源性凋亡(线粒体)途径和外源性凋亡(死亡受体)途径的研究以及环孢霉素A和(CsA)霉酚酸酯(MMF)对两条凋亡途径的干预，探讨老年大鼠肾脏缺血/再灌注损伤诱导的肾小管上皮细胞凋亡变化的机制。方法：老年(27月龄)和青年(3月龄)雄性wistar大鼠按照随机区组设计的原则分别分为假手术组、缺血/再灌注损伤模型组、CsA干预组及MMF干预组。双侧肾动脉夹闭30min再灌注18h制作大鼠肾脏缺血/再灌注损伤模型。比色法测定血清肌酐(SCr)浓度；过碘酸-希夫氏碱(PAS)染色观察肾脏组织病理改变；原位末端标记(TUNEL)法及DNA电泳观察肾小管上皮细胞凋亡情况；比色法测定肾组织超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；Northernblot检测肾组织Bax、Bcl-2、Fas、caspase-3mRNA表达；RT-PCR检测肾组织caspase-8、9mRNA表达；Westernblot检测胞浆细胞色素c、caspase-3、8、9蛋白表达。结果：生理状态下老年大鼠SCr水平明显高于青年大鼠，肾组织可以见到病理改变；肾脏缺血/再灌注损伤时，两年龄模型组大鼠SCr均明显升高，肾脏组织病理改变明显加重，老年鼠的上述变化较青年鼠更为显著(P＜0.05)；老年假手术组大鼠肾组织凋亡细胞数目明显多于相应青年大鼠(分别为1.53±0.24％和0.99±0.17％，P＜0.05)；两年龄模型组大鼠肾小管上皮细胞凋亡程度都较相应假手术组明显加重(P＜0.05)，而老年大鼠的变化较青年大鼠更加明显(TUNEL阳性细胞数分别增加25.70±4.99倍和19.61±2.15倍，P＜0.05)；肾脏缺血/再灌注损伤时，老年及青年模型组大鼠肾组织中SOD活性都明显降低(P＜0.05)，MDA含量都明显增加(P＜0.05)，同时线粒体途径中的相关物质(Bax/Bcl-2、胞浆细胞色素c、caspase-9)和死亡受体途径中的相关物质(Fas、caspase-8)，以及两者共同的下游物质caspase-3的表达都明显增加(P＜0.05)；相同的损伤条件下，老年大鼠SOD活性、MDA含量的变化，以及Bax/Bcl-2、胞浆细胞色素c、caspase-9、caspase-3表达的增加较青年鼠更为明显(P＜0.05)，而Fas和caspase-8表达的变化与青年鼠无明显差异(P＞0.05)。CsA及MMF均能减轻老年及青年大鼠肾小管上皮细胞凋亡(P＜0.05)，但CsA对老年大鼠的作用较青年鼠更为显著(P＜0.05)。结论：肾脏缺血/再灌注损伤时，老年大鼠肾小管上皮细胞凋亡程度较青年鼠重；老年大鼠氧化应激增加所导致的线粒体凋亡途径的增强是其细胞凋亡增加的重要机制。

目录

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前 言

实验研究一老年大鼠肾脏缺血/再灌注损伤诱导肾小管上皮细胞凋亡的变化特点

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

实验研究二老年大鼠肾脏缺血/再灌注损伤诱导肾小管上皮细胞凋亡增加的机制研究

前言

材料与方法

结果

一、肾功能检测结果

二、肾组织病理学检查

三、肾组织细胞凋亡检测

四、肾组织Bax及Bcl-2的Northern blot检测

五、肾组织中SOD活性及MDA含量的检测

六、Western blot检测肾组织胞浆细胞色素c表达

七、Northern blot检测肾组织Fas表达

八、RT-PCR及Western blot检测肾组织caspase-8表达

九、RT-PCR及Western blot检测肾组织caspase-9表达

十、Northern blot及Western blot检测肾组织caspase-3表达

讨论

小结

参考文献

全文总结

综 述肾脏缺血/再灌注损伤中肾小管上皮细胞凋亡机制的研究现状

1细胞凋亡概述

2肾脏I/R损伤中肾上管上皮细胞凋亡的分子机制

3肾脏I/R损伤中凋亡的检测

4I/R损伤的预防和治疗

5结语

参考文献

英文缩略词表

攻读学位期间发表文章情况

致 谢