Gcthionin及其突变体的表达、纯化、抗真菌活性及作用机制研究

摘要

植物防御素通常含有45~54个氨基酸残基，分子量约为4~5 kDa，等电点(PI)通常在9左右，具有广谱的抗真菌活性，部分具有抗细菌活性，能够抑制癌细胞的生长，酶抑制活性，是植物固有免疫系统的重要组成部分。
　　手掌参植物防御素 Gcthionin是我们实验室前期通过筛选手掌参 cDNA文库得到的一种新型防御素。Gcthionin含有45个氨基酸残基，与其它防御素相比，它的7，8位缺失,第20、32、36位为保守的甘氨酸残基(G)，第39位为保守的精氨酸残基外(R)，其余位置的氨基酸残基均非常不保守。Swiss-model预测Gcthionin中八个半胱氨酸残基之间仅形成了三对二硫键。由此可见，Gcthionin在其序列结构和空间结构中存在特殊性。
　　在本论文的研究中，我们通过构建 pET-32(a)-DP-Gcthionin重组质粒，同时在重组质粒中引入了DP甲酸切割位点。为了研究特殊氨基酸对Gcthionin功能影响，我们挑选了特殊位置进行了PCR的定点突变。在对野生型质粒使用BL21(DE3)宿主菌进行原核诱导表达，表达的融合蛋白Trx-Gcthionin经Ni2+亲和层析后，分别采用两种方法进行酸切割，研究了不同酸切割方式对融合蛋白的影响，并进行了Tricine-SDS-PAGE检测；此外我们使用纸片法和孢子萌发实验，检测了野生型和部分突变体以及人工合成多肽的抗禾谷镰刀菌活性。
　　通过测序检测，我们成功构建了T10F突变体，R31G突变体，以及I37FL38R突变体，以及 I42终止突变体。通过突变体的构建，我们发现某些突变体在实际构建中是无法实现的，如7位，8位构建比较困难，同时某些突变体即使构建成功，由于自身的细胞毒性，也无法成功表达得到。突变体的构建为下一步研究机理奠定了基础。
　　经过原核表达得到的融合蛋白 Trx-D-P-Gcthionin，通过比较50％甲酸和pH=1.2两种切割方式切割，发现两种方法均能对融合蛋白进行有效的切割，得到的大小片段可以进一步分离纯化。
　　此外在抗真菌实验中，纸片法(PD法)的使用让我们发现野生型和突变体融合蛋白能够有效抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长，抑制的效率和浓度呈现线性关系，同时在抑制禾谷镰刀菌孢子萌发的实验中，我们观察到Gcthionin及它的化学法合成多肽均能高效抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发，处理后的孢子在72 h后仍未见萌发，从而达到抗真菌的目的，关于其详细的抗真菌机制尚待深入研究。

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第一章 绪 论

1.1植物防御素的发现与发展

1.2 论文研究内容

第二章 基于定点突变的Gcthionin突变体构建

2.1 材料和方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

第三章 Gcthionin的原核表达及纯化

3.1 实验材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

第四章 重组Trx-Gcthionin的甲酸切割

4.1 材料和方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

第五章 Gcthionin的抗菌活性

5.1 实验材料与方法

5.2 实验结果

5.3 抗细菌活性

5.4 讨论

第六章 展 望

6.1 Gcthionin突变

6.2 Trx-Gcthionin纯化及切割

6.3 Gcthionin抗菌活性

致谢

参考文献

攻硕期间的研究成果