重组1型腺相关病毒介导hHGF转染ADMSCs治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究

摘要

目的：观察rAAV1-EGFP转染对于脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)生物学特性的影响；检测rAAV1-EGFP体外转染ADMSCs后，ADMSCs-EGFP同种异体移植能否在梗死心肌局部持续表达外源性EGFP。研究rAAV1-1HGF体外转染对于ADMSCs分泌功能的影响；探讨同种异体ADMSCs-hHGF移植治疗大鼠急性心肌梗死的可行性及有效性。 方法：(1)观察rAAV1-EGFP转染对于ADMSCs生物学特性的影响。取雄性Wister大鼠附睾处脂肪组织，消化分离法获取ADMSCs，体外培养、扩增及鉴定，rAAV1-EGPF转染，观察转染后ADMSCs生长特点、表面特异性标记、多向分化潜能的变化情况。(2)鉴定同种异体ADMSCs-EGFP移植能否在急性心肌梗死大鼠的心肌局部持续表达外源性EGFP。将60只雄性Wister大鼠随机平均分为阴性对照组(n=15)、细胞移植1周组(n=15)、细胞移植4周组(n=15)、细胞移植8周组(n=15)，采用结扎冠状动脉左前降支的方法制备急性心肌梗死模型，采用经心外膜心肌直接注射的方法，于心肌梗死区及其周围分别注射PBS(阴性对照组)和ADMSCs-EGFP(细胞移植组)，分别于术后1周末、4周末及8周末处死细胞移植组大鼠，应用荧光显微镜、EGFP免疫组织化学染色和图象分析方法检测同种异体ADMSCs-EGFP移植能否在急性心肌梗死大鼠的心肌局部持续性表达外源性EGFP。术后8周末处死PBS组大鼠作为阴性对照。(3)构建rAAV1-hHGF。ADMSCs接种至6孔板，接种细胞随机分为未转染组(阴性对照组)和rAAV1-hHGF转染组，应用酶联免疫吸附方法(ELISA)测定转染hHGF后第1～8天内每日细胞上清液中hHGF浓度的变化情况，同时进行细胞计数，观察细胞分泌能力的改变。(4)同种异体ADMSCs移植联合转基因hHGF治疗大鼠急性心肌梗死。将100只雄性Wister大鼠随机平均分为PBS组(n=25)，单纯ADMSCs治疗组(n=25)，单纯hHGF治疗组(n=25)，ADMSCs-hHGF治疗组(n=25)，采用结扎冠状动脉左前降支的方法制备急性心肌梗死模型，经心外膜心肌直接注射的方法给予相应治疗。术后8周末采用导管法及超声心动检测判定心脏功能，随后处死实验动物，行形态学检测并计算梗死面积(IS)、左室球形指数(S1)和扩张指数(DI)，天狼猩红染色测定梗死区及非梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原容积分数(CVF)，免疫组织化学染色检测局部血管密度及MMP-2和MMP-9表达，行组织匀浆，应用RT-PCR法测定梗死组织中hHGF的mRNA水平，应用Western blotting法测定梗死组织中hHGF蛋白表达情况。 结果：(1)rAAv1-EGFP转染后，大鼠ADMSCs可正常贴壁，生长迅速，细胞倍增时间(DT)约52.5h，多次传代后形态上无明显改变，其细胞表面特异性标记及多向分化潜能未受明显影响。(2)同种异体转基因ADMSCs-EGFP移植后，1周及4周时于梗死心脏局部均可观察到绿色荧光及相应部位EGFP的表达，两者相比无显著差异，移植后8周时梗死局部绿色荧光明显减弱，但仍可见少量EGFP表达。对照组未观察到绿色荧光及相应部位EGFP的表达。(3)成功构建携带目的基因hHGF的rAAV1。与未转染组相比，转基因ADMSCs-hHGF组上清液中hHGF的浓度及细胞分泌hHGF的能力均显著增加。(4)心肌梗死8周后，与PBS组相比，单纯ADMSCs组和转基因ADMSCs-hHGF组射血分数(EF)、左室搏出量(LVSV)及左室舒张末容积(LVEDV)显著增加，+dt/dpmax、+dt/dpmax/LVSP以及-dt/dpmax、-dt/dpmax/LVSP显著升高，左室相对重量显著增加，梗死区及边缘区Ⅰ、Ⅲ型胶原容积分数均显著降低，而局部血管数目显著增多，MMP-2、MMP-9显著减少，但细胞凋亡指数(AI)没有明显变化。与单纯ADMSCs组相比，转基因ADMSCs-hHGF组局部血管数目增加更为明显，而MMP-9减少程度低于前者。同时，在细胞移植8周后，单纯hHGF组和转基因ADMSCs-hHGF组于大鼠梗死心肌组织中均可检测到hHGF的mRNA及相关蛋白表达。 结论：rAAV1转染未明显影响ADMSCs的生物学特性；在心肌梗死区域移植ADMSCs-EGFP，术后4周于移植区域仍可检测到外源性EGFP持续性表达。rAAV1-hHGF转染后可提高ADMSCs分泌hHGF的能力；ADMSCs-hHGF能够在移植区域持续表达hHGF，并可提高ADMSCs新生血管功能，有助于急性心肌梗死后心脏功能的恢复。

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文摘

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论文说明：缩略词表

声明

前言

rAAV1-hHGF转染ADMSCs冶疗大鼠AMIR实验研究路线图

第一部分 重组1型腺相关病毒转染ADMSCs的实验研究

目的

材料

方法

结果

讨论

结论

第二部分 同种异体转基因ADMSCs-hHGF治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究

目的

材料

方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

附图

综述 脂肪源性间充质干细胞研究新进展

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