基于“肾为先天之本”2型糖尿病肾虚证的miRNA研究

摘要

目的:
　　糖尿病已经成为威胁人民健康的重要非传染疾病之一，在我国尤其以2型糖尿病为主。2型糖尿病的发病既有复杂的遗传背景，同时与环境等因素密切相关。以2型糖尿病为载体，从中医“肾为先天之本”理论为基础，能够更好的阐述“遗传-环境-疾病”相互作用和中医的整体观。本文在前期全基因组表达谱研究平台上,引入miRNA芯片技术，旨在探索2型糖尿病肾虚证的表观遗传学机制。
　　1.通过对中医古籍中消渴病的梳理和对现在表观遗传学方法的探讨，从理论上讨论将表观遗传学方法引入到中医藏象学的研究的创新和应用价值。
　　2.通过对793例成都地区2型糖尿病患者的家族史回顾性调查，揭示遗传因素对肾虚证的影响。
　　3.从2型糖尿病患者中筛选出8例典型肾虚证和非肾虚证患者，并分别和4例正常人对比，分析差异表达miRNA并筛选意义较大的miRNA进行PCR验证，从分子水平初步探讨肾虚证糖尿病的分子机制变化。
　　方法：
　　1．2型糖尿病人群的病证结合研究：采用肾虚证辨证因子及等级量化表对2型糖尿病人群面对面进行病证结合调查，采用统计学分析方法，探讨分析肾虚证糖尿病人群的分布特征。
　　2．miRNA表达谱芯片异常表达基因的筛选：采用miRNA表达谱芯片技术，对筛选的12例样本分3组两两对比，进行miRNA基因表达谱试验，对差异miRNA进行靶基因预测。
　　3．对miRNA表达谱芯片分析结果的qPCR验证：通过筛选出的“肾虚-非肾虚”组FC较大的差异miRNA，通过PCR方法进一步验证分析结果。
　　结果：
　　1. 通过对历代中医古籍文献的梳理发现肾虚是消渴发病的重要因素之一。结合表观遗传学方法，能丰富2型糖尿病的肾虚证候微观本质。
　　2．调查2型糖尿病病患793例,有明确家族史的患者169例，占全部21.3％,其发病率无性别差异。有2型糖尿病家族史组的肾虚患者百分比明显高于无2型糖尿病家族史组，两组肾虚患者人数百分比比较有统计学意义，提示“肾虚”可能在2型糖尿病家族聚集中起一定的作用。
　　3. 肾虚证、非肾虚证糖尿病及正常对照组三组样本两两比较分别筛选出差miRNA。其中肾虚与非肾虚组差异miRNA13条；肾虚与健康对照差异12条；非肾虚与正常对照差异11条。
　　4.在对“肾虚-非肾虚”miRNA芯片结果中筛选出3条候选差异miRNA：miR-335，miR-377和miR-497，用于qPCR验证。qPCR结果与芯片结果结果一致，miR-335，miR-377和miR-497在肾虚组中的表达均高于非肾虚组，但组间差异不显著（P>0.05）。
　　结论：
　　1．将表观遗传学引入到对中医藏象、证候及中医遗传等很多问题的研究能够有所突破。同时能够更好的阐述“肾为先天之本”的生物学意义。
　　2．通过对2型糖尿病患者家族史的回顾研究发现2型糖尿病存在家族聚集现象,肾虚对2型糖尿病家族聚集趋势起一定的作用。
　　3. 2型糖尿病肾虚证在特征性miRNA主要涉及机体免疫及细胞周期等方面有关，提示肾虚在2型糖尿病中可能机理为降低组织细胞功能。
　　4．miRNA表达谱芯片的结果及前期基因芯片结果基本一致，提示2型糖尿病肾虚证的机制涉及多层面的改变，后期有深入研究的必要。

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缩略词

前言

第一部分 消渴的历史源流及表观遗传学研究藏象理论的意义

1.消渴(糖尿病)的历史源流

2．miRNA的相关背景及研究方法

3．运用表观遗传学方法研究中医“肾为先天之本”的理论依据与学术价值

4.小结:

第二部分 2型糖尿病肾虚证的家族背景调查研究

引言

1.调查对象与方法

2. 结果

3.讨论

4.小结

第三部分T2DM肾虚证的miRNA表达谱研究

引言

1.实验对象与纳入标准

2.实验材料与方法

3．结果

4. 讨论

5.小结

第四部分 T2DM肾虚证miRNA的qPCR验证

引言

1. 材料与方法

2. 实验结果

3.讨论

4.小结

参考文献

结论

致谢

综述: 表观遗传学在T2DM研究及肾本质研究进展

1.表观遗传学在T2DM中的研究进展

2. 肾本质的研究进展

参考文献

附件1：肾虚证辩证因子及等级量化表

附件2：miRNA芯片及qPCR所选样本肾虚量表评估

附件3：公开发表的学术论文、专著及科研成果

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