基于PI3K/AKT信号通路研究新加归肾丸调节大鼠卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的分子机制

摘要

第一部分：雷公藤多苷致体外培养大鼠卵巢颗粒细胞损伤量效关系的研究
　　目的：获取不同剂量雷公藤多苷灌胃大鼠的含药血清，用MTT法研究雷公藤多苷致体外培养大鼠卵巢颗粒细胞损伤的量效关系。
　　方法：160mg/kg·d（A）、80mg/kg·d（B）、40mg/kg·d（C）三种不同剂量雷公藤多苷（GTW）灌胃大鼠，每天2次，4天后采血，制备大鼠含药血清分为GTW-A、GTW-B、GTW-C三组；将获取的大鼠卵巢颗粒细胞分为4组，以4.9mg/L顺铂为阳性参照组，用MTT法测得顺铂组、GTW-A、GTW-B、GTW-C四组药物作用颗粒细胞48小时后的OD值进行比较；用酶联免疫法（Elisa）测得不同药物作用后颗粒细胞雌二醇（E2）分泌量。
　　结果：80mg/kg.d雷公藤多苷含药血清对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞抑制作用与顺铂比较无统计学差异（P>0.05），雌二醇（E2）分泌量与顺铂组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　结论：80mg/kg·d雷公藤多苷含药血清作用于体外培养大鼠卵巢颗粒细胞，能获得与顺铂相同的抑制效果。
　　第二部分：新加归肾丸对受雷公藤多苷抑制体外培养大鼠卵巢颗粒细胞PI3K/AKT信号通路的影响
　　目的：在第一部分实验的基础之上，选用与颗粒细胞发育密切相关的PI3K/AKT信号通路为切入点，从细胞增殖、凋亡两方面探讨雷公藤多苷抑制体外培养大鼠卵巢颗粒细胞以及补肾活血复方中药促体外培养大鼠颗粒细胞增生与PI3K/AKT信号通路的相关性。
　　方法：将培育成功的大鼠卵巢颗粒细胞分为5组：正常对照组、GTW组、促卵泡生成素（FSH）组、GTW+中药低剂量组、GTW+中药高剂量组。正常对照组给予等量蒸馏水灌胃大鼠获取的血清，其余四组先加入80mg/kg·d雷公藤多苷大鼠含药血清作用48小时后，于FSH组加入含FSH大鼠血清，中药低剂量组和中药高剂量组分别加入相应剂量的大鼠含药血清，48小时后，逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测颗粒细胞中PI3K/AKT信号通路中的主要信号分子：p-AKTmRNA、p-mTORmRNA、p-p70S6KmRNA、PTENmRNA相对表达水平；蛋白质免疫印迹实验法（western-blotting)检测颗粒细胞中cyclinD2、PCNA、caspase-3、survivin蛋白含量；用Elsia法测定颗粒细胞分泌雌二醇（E2）、孕酮（P）量。分别将cyclinD2、caspase-3与p-AKT；cyclinD2与PCNA；caspase-3与survivin在卵巢颗粒细胞中的表达进行相关性分析。
　　结果：①与正常对照组相比，GTW组颗粒细胞上的p-AKTmRNA相对表达、p-mTORmRNA相对表达、p-p70S6KmRNA相对表达均降低，差异有统计学意义（P﹤0.05或P﹤0.01）；cyclinD2、PCNA、survivin蛋白含量均降低，差异有统计学意义（P﹤0.05或P﹤0.01）；caspase-3蛋白含量均升高，差异有统计学意义（P﹤0.05或P﹤0.01）；PTENmRNA相对表达量无统计学意义（P>0.05）；颗粒细胞分泌雌二醇（E2）、孕酮（P）水平均降低，差异有统计学意义（P﹤0.05或P﹤0.01）。②应用不同剂量的补肾活血复方中药新加归肾丸大鼠含药血清作用48小时后，中药高剂量组与GTW组相比，颗粒细胞中p-AKTmRNA相对表达、p-mTORmRNA相对表达、cyclinD2蛋白含量、PCNA蛋白含量、survivin蛋白含量均升高，差异有统计学意义（P﹤0.05或P﹤0.01）；caspase-3蛋白含量均降低，差异有统计学意义（P﹤0.05或P﹤0.01）；PTENmRNA相对表达量无统计学意义（P>0.05）；颗粒细胞分泌雌二醇（E2）、孕酮（P）水平均升高，差异有统计学意义（P﹤0.05或P﹤0.01）。中药低剂量组与GTW组相比，颗粒细胞中p-AKTmRNA升高，颗粒细胞分泌雌二醇（E2）、孕酮（P）水平升高，差异有统计学意义（P﹤0.05或P﹤0.01）；其他指标均无统计学意义（P>0.05）。③相关性分析结果：颗粒细胞中cyclinD2与p-AKT表达呈显著正相关关系（r=0.770，P<0.01）；颗粒细胞中caspase-3与p-AKT表达呈显著负相关关系（r=-0.779，P<0.01）；颗粒细胞中cyclinD2与PCNA表达呈显著正相关关系(r=0.547，P<0.05)；颗粒细胞中caspase-3与survivin表达呈显著负相关关系（r=-0.732，P<0.01）。
　　结论：雷公藤多苷可能通过抑制卵巢颗粒细胞中PI3K/AKT信号通路信号分子AKT的级联激活反应，抑制其下游信号分子p-mTOR、p-p70S6K的活化，上调PTEN表达，使有丝分裂信号传导受阻，颗粒细胞cyclinD2蛋白含量降低，阻碍细胞周期进程，抑制颗粒细胞增殖，PCNA在颗粒细胞上的蛋白含量降低；另一方面，上调凋亡因子caspase-3蛋白含量，下调抗凋亡因子survivin蛋白含量，促使颗粒细胞过度凋亡，进而导致颗粒细胞分泌E2、P降低。而补肾活血中药复方新加归肾丸可解除雷公藤多苷的抑制作用，一方面促使p-mTOR、p-p70S6K的活化，下调PTEN表达，下传有丝分裂信号，使颗粒细胞cyclinD2蛋白含量增加，促进细胞周期进程，PCNA在颗粒细胞上的蛋白含量增加；另一方面，下调凋亡因子caspase-3蛋白含量，上调抗凋亡因子survivin蛋白含量，抑制颗粒细胞过度凋亡，进而促进颗粒细胞E2、P的分泌。

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英文缩略词表

引言

第一部分 卵泡发育障碍的理论研究

1卵泡发育障碍与肾虚血瘀病机的相关性

2 PI3K/AKT细胞信号通路与卵泡发育相关性的研究进展

3 导师对卵泡发育障碍的认识

4 本课题的创新点

第二部分 实验研究

实验一 雷公藤多苷致体外培养大鼠卵巢颗粒细胞损伤量效关系的探讨

实验二 基于PI3K/AKT信号通路研究新加归肾丸修复雷公藤多苷致大鼠卵巢颗粒细胞损伤的实验研究

结论

问题与展望

一、存在的问题

二、展望

致谢

参考文献

附件

附件1顺铂与不同剂量雷公藤多苷含药血清作用于大鼠卵巢颗粒细胞

附件2不同药物作用于大鼠卵巢颗粒细胞后

综述：卵泡发育障碍的中西医研究进展

综述：卵巢颗粒细胞体外培养研究概况

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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