线粒体DNA编码蛋白质在炎症反应中作用的初步探讨

摘要

第一部分，目的：创伤导致机体出现全身炎症反应综合征,甚至发生多器官功能衰竭。目前认为创伤后大量线粒体破裂,线粒体内由其自身DNA编码合成的蛋白质释放入血,是导致无菌性炎症的重要因素。细胞色素b是由线粒体DNA编码合成的一种蛋白质。本文通过动物实验分析细胞色素b和炎症反应相关性、体内实验细胞色素b活化巨噬细胞释放炎症因子的检测、体外实验大鼠膝关节腔内注射细胞色素b诱导关节炎发生三部分,初步探讨细胞色素b在无菌性炎症反应中所起的作用,为严重创伤后SIRS的发生、多器官损伤及相关并发症的研究提供新思路。
　　方法：第一部分动物实验:制备大鼠双侧股骨干骨折模型,分别在创伤后第1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时、36小时用酶联免疫吸附试验法(ELISA)观测外周血中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的表达;第二部分体外实验:将大鼠腹腔巨噬细胞分为培养基对照组、mtDNA(10ug/ml)组;Cyt-b(0.1ug/ml)组、Cyt-b(1ug/ml)组、Cyt-b(10ug/ml)组共5组进行刺激,分别在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时和36小时,用酶联免疫吸附试验法(ELISA)观测培养液中TNF-α、IL-1、IL-6、的表达水平;第三部分动物实验将大鼠分为空白对照(缓冲液)组、mtDNA(10ug/ml)组、Cyt-b(10ug/ml)组,分别进行膝关节内注射,5天后用HE染色观察膝关节病理学变化。实验资料采用均数±标准误(x±s)表示。所有数据运用SPSS17.0统计软件采用组内t检验、组间F检验及相关回归分析进行差统计学处理,p<0.05表示差异有显著统计学意义。
　　结果：1.创伤后大鼠外周血中细胞色素b含量在4小时达到高峰,后逐渐下降,TNF-α在6小时达到高峰,IL-10、IL-6于10小时达到高峰,后逐渐下降;细胞色素b与炎症反应呈正相关性。2.对照组和低、中浓度Cyt-b组三种炎症因子TNF-α,IL-1,IL-6表达没有明显变化趋势,高浓度Cyt-b组和mtDNA组炎症因子表达随时间变化增加。高浓度Cyt-b可活化大鼠巨噬细胞释放炎症因子TNF-α,IL-1,IL-6。3.关节内注射高浓度Cyt-b和mtDNA组的大鼠膝关节病理学表现为明显炎症细胞浸润、滑膜增厚,关节炎发生率和严重程度均高于对照组。
　　结论：Cyt-b和创伤后炎症反应呈正相关,高浓度Cyt-b和mtDNA均能通过刺激巨噬细胞产生炎症因子,并在体外导致炎症反应的发生。
　　第二部分，目的：创伤后机体失控性炎症反应综合征已成为全球青壮年的首要死亡原因。线粒体DNA编码的蛋白质,在结构和功能上与细菌类似,其特异结构N-甲酰甲硫氨酸会被FPR-1或FPRL-1识别为外源性物质并启动机体固有免疫系统,可激活机体固有免疫产生炎症因子,导致无菌性炎症发生。本文主要检测严重创伤大鼠外周血中Cyt-b和炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6不同时间表达变化,观察Cyt-b含量与损伤程度的关系。
　　方法：采用动物实验研究:制备双侧股骨干骨折创伤大鼠模型(n=27),分别在第1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时、36小时通过颈动脉置管抽取血液样本,用酶联免疫吸附试验法(ELISA)观测外周血中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的表达,采用SPSS17.0SPSS17.0统计软件采用回归与相关分析。
　　结果：创伤后大鼠血液中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的含量均呈现出高峰并在随后呈现逐步下降趋势,Cyt-b的峰值出现在约创伤后第4小时,TNF-α在6小时达到高峰,IL-1、IL-6于10小时达到高峰。
　　结论：细胞色素b与炎症反应程度呈正相关性:外周血Cyt-b浓度越高,炎症因子浓度越高。
　　第三部分，目的：创伤后全身炎症反应综合征是创伤及烧伤后严重并发症,微生物感染不是导致创伤后SIRS的唯一致病因素。细菌蛋白质含N-甲酰甲硫氨酸,该结构会被FPR-1或FPRL-1识别为外源性物质并激活机体固有免疫系统。线粒体DNA编码蛋白质之一细胞色素b,和细菌蛋白质具有相同的N-甲酰甲硫氨酸结构,因此假设Cyt-b也应该像细菌蛋白质一样能通过FPR-1或FPRL-1受体激活固有免疫系统。本研究拟通过体外实验研究,验证Cyt-b能否通激活巨噬细胞产生炎症细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。
　　方法：采用体外实验研究:SD大鼠腹腔提取巨噬细胞,纯化后置入培养板中培养。分为5组:对照组;mtDNA(10ug/ml)组;Cyt-b(0.1ug/ml)组;Cyt-b(1ug/ml)组;Cyt-b(10ug/ml)组分别加入哦0.2ml的RPMI1640,10ug/ml的mtDNA,0.1ug/ml的Cyt-b,1ug/ml的Cyt-b及10ug/ml的Cyt-b,在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时和36小时,用酶联免疫吸附试验法(ELISA)观测外周血中TNF-α、IL-10、IL-6、的表达水平;
　　结果：对照组和低、中浓度Cyt-b组三种炎症因子TNF-α,IL-1,IL-6表达没有明显变化趋势,与对照组无统计学差异;高浓度Cyt-b(10ug/ml)组和mtDNA(10ug/ml)组炎症因子表达随时间变化增加,与对照组比较统计学差异明显,P<0.01,高浓度Cyt-b组和mtDNA组间无统计学差异。
　　结论：高浓度Cyt-b可活化大鼠巨噬细胞释放炎症因子TNF-α,IL-1,IL-6
　　第四部分，目的：第一、二部分实验证实细胞色素b与创伤后炎症反应有关,Cyt-b可在体外激活巨噬细胞产生炎症因子IL-1和IL-6和TNF-α,但Cyt-b能否体内与机体细胞相应受体结合,启动无菌性炎症仍然未知,为此本部分采用动物体内实验研究,观察注射外源Cyt-b后,能否导致局部炎症反应。
　　方法：3月龄雄性SD大鼠随机分为缓冲液组(n=8);mtDNA(10ug/ml)组(n=8);Cyt-b(10ug/ml)组(n=8)共三组。于膝关节腔内分别注入缓冲液、10ug/ml的mtDNA、10ug/ml的Cyt-b各0.2ml。所有大鼠7天后处死用HE染色观察膝关节病理学变化,按Mankin’s骨关节病组织分类法对软骨和滑膜进行评分。
　　结果：关节内注射高浓度Cyt-b和mtDNA可导致关节炎的发生,两组的发病率明显高于对照组,P<0.01。Cyt-b组和mtDNA组mankin’s评分明显高于对照组。
　　结论：Cyt-b(10ug/ml)可在通过外源性的关节腔内注射诱导关节炎的发生。

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线粒体DNA编码蛋白质在炎症反应中作用的初步探讨

前言

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第一部分：创伤后大鼠体内Cyt-b与炎症反应相关性的实验研究

1．实验材料

2．实验方法和分组:

3.结果

讨 论

结论

参考文献

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英文摘要

第二部分：细胞色素b活化巨噬细胞的体外实验研究

1. 材料与方法

2结果

3 讨论

4 结论

参考文献

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第三部分： 细胞色素b导致炎症反应的体内实验研究

1.材料与方法

2. 实验方法

3.结果

4 讨论：

5. 结论

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表文章情况

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