基于“提壶揭盖”法探讨越婢汤调控不稳定膀胱模型的机理研究

摘要

研究目的:
　　本课题将以膀胱Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)为研究对象，以内质网应激--未折叠蛋白反应为切入点，揭示越婢汤调节膀胱样ICC细胞数量，从而改善膀胱不稳定状态所致的遗尿症的本质以及相关机制，同时为中医“提壶揭盖”法从现代实验科学做出前期依据。
　　研究方法:
　　实验一：采取近端尿道结扎法建立膀胱出口梗阻（ bladder outlet obstruction,BOO）动物模型，并制备膀胱ICC样细胞悬液，然后将BOO造模成功的wistar大鼠，雌性，60只，尾部流水编号随机分成越婢汤中药古方组、越婢汤高剂量组、越婢汤中剂量组、越婢汤低剂量组、缩泉丸组、灭菌水对照组6组。煎熬中药并依次大鼠灌胃，每只2ml，早晚各灌1次，连续灌14d。对照组予灭菌水灌胃，每只2ml，早晚各1次，连续灌14d。在最后一次给药2h内，于腹主动脉处取血，制备含药血清。
　　实验二：在实验一基础上，予越婢汤各组含药血清干预膀胱ICCs，观察EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,EDU)染色法中细胞增殖的变化，用 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferasedUTP nick end labeling,TUNEL)法染色检测细胞凋亡和CFSE(Carboxyfluorescein succinimidylester,CFSE)/PI( Propidium Iodide,PI)双染检测细胞存活率。
　　实验三：观察越婢汤对膀胱ICCs内质网应激相关通路中促生存信号和促凋亡信号的影响，通过转录水平，蛋白定量、蛋白定性的不同层次，分别测定了活化转录因子6(Activating transcription factor6,ATF6)、葡萄糖调节蛋白78( Glucose-regulated protein78, GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶12(Cysteine aspartic acid specific protease12,caspase-12)、c-JUN氨基端激酶( C-JUN NH2-terminal kinase,JNK)等相关基因的表达情况。实验四：采用Fluo3-AM探针标记钙离子，荧光显微镜观察绿色荧光强度，检测细胞内钙离子的浓度。
　　研究结果:
　　1.体外ICC样细胞的培养和鉴定：大鼠膀胱处提取细胞，24h后细胞贴壁，细胞形态与文献报道基本一致，光学图片证实雌性大鼠膀胱内Cajal样细胞的存在。进一步实验用c-kit免疫荧光染色法标记cajal细胞，结果呈阳性（绿色荧光），胞体和突起均明显着色，再次证实了所提取的细胞为cajal间质细胞。
　　2.含药血清对ICCs增殖的影响：灭菌水对照组ICCs有最强的增殖能力；越婢汤低-中-高剂量组，随着药物浓度的增加，对ICC细胞的增殖能力逐渐减弱，其中古方组与低剂量组中细胞的增殖能力接近；缩泉丸组药物血清可影响细胞的增殖能力，与越婢汤高剂量组细胞的增殖能力接近。
　　3.含药血清对ICCs凋亡的影响：灭菌水对照组无诱导细胞凋亡的能力；越婢汤低﹑中﹑高3组，随药物浓度升高凋亡细胞增多，呈一定量效关系。缩泉丸组和古方组中的凋亡细胞较少，且与低剂量中的凋亡细胞数目基本相同，表明这3组药物对细胞凋亡能力接近。
　　4.促生存信号的表达：从转录水平，蛋白定量、蛋白定性的不同层次来看，越婢汤各剂量组ATF6﹑GRP78等促生存信号的表达增高明显，与灭菌水对照组比较，具有显著性差异（P＜0.05）。且随着越婢汤从低-中-高，浓度的不断升高，ATF6﹑GRP78蛋白的表达量不断增加，呈剂量依赖性。缩泉丸组ATF6﹑GRP78蛋白的表达明显，与灭菌水对照组比较，亦具有显著性差异（P＜0.05）。
　　5.促凋亡信号的表达：从转录水平看，越婢汤各组可下调其mRNA表达水平；但是从蛋白定性﹑半定量来看，越婢汤不同剂量组对JNK、CHOP、caspase-12的蛋白表达量影响不明显，与灭菌水对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。缩泉丸组24h后3个不同层次CHOP﹑JNK﹑caspase-12等基因的表达呈低水平表达，但与灭菌水对照组比较，差异亦无统计学意义（P＞0.05）。
　　6.含药血清对细胞内游离钙浓度的影响：含药血清处理ICC细胞24h后越婢汤低﹑中﹑高﹑古方各组，缩泉丸组均未引起细胞内Ca2+浓度的升高。
　　研究结论:
　　1.越婢汤可以显著抑制Cajal细胞的增殖能力，但诱导细胞凋亡能力不足。
　　2.越婢汤可以下调膀胱样ICC细胞数量，进而调节膀胱不稳定状态所致的遗尿症。其可能的机理是：越婢汤通过内质网应激--未折叠蛋白反应，诱导了ATF6﹑GRP78等促生存信号的高表达，恢复了ICC细胞的正常生理功能，维持了内质网的稳态。
　　3.从中医“提壶揭盖”方向论治遗尿症的方法可行。

目录

英文缩写一览表

引言

研究背景

立题依据

研究内容

技术路线

第一部分 文献研究

1祖国医学对遗尿症的认识

2提壶揭盖法--越婢汤--遗尿症

3遗尿症--膀胱功能障碍--Cajal间质细胞

4内质网应激

第二部分 动物实验研究

实验一 体外ICC样细胞的培养和鉴定

实验二 中药含药血清对膀胱Cajal间质细胞增殖与凋亡的影响

实验三 从转录水平，蛋白定量、蛋白定性的不同层次，分别测定相关调控因子

实验四 含药血清对细胞内游离钙浓度的影响

总结论

创新点

问题与展望

致谢

参考文献

附件1：综述1:非补肾”类内治法治疗小儿遗尿症的用药规律研究

附件2：综述2:小儿遗尿症的中医治疗进展

附件3：在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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