新型可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的构建及表达

摘要

研究背景:
　　肾癌是当今社会人们面临的危害人类健康的重要疾病,特别是对失去手术机会的转移性肾癌目前还没有令人满意的治疗方法,其他方法诸如放疗,化疗或内分泌治疗对肾癌治疗效果比较局限,细胞因子等虽然会对部分病人有疗效,但是强烈的毒副作用影响了它的应用。因此,晚期肾癌的治疗迫切需要新的更加有效的治疗方法。
　　研究目的:
　　本研究是将肾癌G250抗原与一种基于塞姆利基森林病毒(SFV)的载体共同构建成为新型的肾癌疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7,并构建表达人G250基因的renca细胞系小鼠荷瘤模型,为后续的抑瘤活性研究及免疫学机制研究打下坚实的基础。
　　方法:
　　1,将本室验证具有良好抗肿瘤活性的DNA疫苗中克隆出异种化G250融合基因片段,克隆入pSVK载体,构建成新型的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7。质粒体外转染293T细胞后用WesternBlot验证其在体外培养细胞中的表达能力,通过肌肉注射加上电脉冲刺激的方法免疫小鼠,剥取免疫部位肌肉组织进行免疫组化分析,对其活体内抗原的表达进行验证。
　　2,采用PCR扩增出人的G250基因编码区长度的互补序列,根据DNA重组技术定向插入到pIRES-neo真核表达载体中,得到重组表达质粒pIRES-neo-G250。用阳离子脂质体介导法将该质粒稳定转染到小鼠renca细胞中,通过调整G418的浓度筛选出阳性的克隆,用蛋白免疫印迹和免疫荧光测试验证人G250基因转染小鼠renca细胞株后的表达情况,利用上述细胞株分别以不同的浓度接种Balb/c小鼠,观察稳定转染外源基因后renca细胞的致瘤能力,建立表达人G250的小鼠肾癌模型。
　　结果:
　　(1)成功构建了新型可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7,利用westernblot及免疫组化的方法对该疫苗的体内外表达进行了验证,结果表明有良好的表达。(2)成功筛选出了稳定表达人G250基因的小鼠renca细胞株,利用westernblot,RT-PCR,流式细胞术及免疫荧光法检测了抗原分子的表达,并建立了表达人G250的小鼠肾癌模型,为后期研究新型可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7的抑瘤作用提供了实验依据。
　　讨论:
　　综上所述,所构建的新型可复制性抗肿瘤DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7构建成功,并能在体内和体外进行有效的表达,同时构建的人G250的小鼠肾癌模型也构建成功。为该疫苗下一步的抑瘤活性研究及免疫学机制研究提供了良好的实验基础。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分新型可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7的构建及体内外表达研究

1 材料

1.1实验动物、菌株和质粒

1.3 主要仪器设备

2 方法

2.1 pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7重组质粒的构建

2.2 重组质粒pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7的体外验证

2.4重组质粒pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7的体内验证

3 结果

3.1重组质粒pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7菌液PCR鉴定

3.2重组质粒pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7的酶切鉴定

3.3 Western印迹检测重组质粒pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7的表达情况

3.4 免疫组化法检测肿瘤抗原在Balb/c小鼠体内的表达

4.讨论

参考文献

第二部分稳定表达人G250的renca小鼠细胞株及人G250小鼠肾癌模型的建立

1 材料

1.1实验动物、菌株和质粒

1.2 酶和实验试剂

1.3 主要仪器设备

2 方法

2.1 人G250基因的扩增

2.2 扩增产物琼脂糖凝胶切胶纯化

2.3 纯化产物与pIRES-neo载体的连接

2.4. 重组质粒pIRES-neo-G250的双酶切鉴定

2.5 重组质粒pIRES-neo-G250的稳定转染

2.6 稳定转染细胞的单克隆化

2.7 稳定转染pIRES-neo-G250细胞株的表达能力检测

2.8人G250小鼠肾癌模型的建立

3 结果

3.1人G250序列的扩增

3.2 pIRES-neo-G250的构建

3.3 流式细胞仪分析

3.4 免疫荧光检测

3.5 RT-PCR检测

3.6 Western印迹检测

3.7，人G250小鼠肾癌模型的建立

4讨论

参考文献

结论

攻读学位期间发表文章情况

致谢