腺病毒介导的VEGF-siRNA抑制骨肉瘤及其肺转移的实验研究

摘要

目的：通过RNA干扰技术抑制骨肉瘤细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,研究抗血管生成治疗骨肉瘤及其肺转移的作用。方法1.在293细胞内扩增已构建的携带有人VEGF-siRNA的腺病毒载体(Ad-VEGF-siRNA,国家自然科学基金资助项目,编号:30271314),通过氯化铯密度梯度离心法纯化和50％组织培养感染剂量法(TCID50)进行滴度测定,并通过100 MOI的Ad-VEGF-siRNA感染Hela细胞对其安全性进行评价;2.细胞实验:以Ad-VEGF-siRNA体外转染MG63细胞株,以免疫组化的方法分析转染后该细胞内VEGF的表达情况;3.动物实验:①以MG63细胞悬液(1×106/ml)皮下接种法,建立荷人骨肉瘤裸鼠动物模型;②实验分组:30只裸鼠接种后7天随机分为A、B、C3组,每组10只。各组于细胞接种后的第7天开始自尾静脉给药。A组注射Ad-VEGF-siRNA100μl,隔日注射,每周注射3次,共注射9次。总量为2×109 pfu;B组注射Ad-EGFP100μl,隔日注射,每周注射3次,共注射9次。总量为2×109pfu;C组注射PBS,隔日注射,每周注射3次,共注射9次。实验自接种开始共26天。各组分别于接种的14天和26天处死5只裸鼠,取血、取瘤、取肺。④.以荧光实时定量PCR(real time PCR)测定各组动物模型肿瘤组织中VEGF-mRNA的含量;⑤.ELISA法检测各组裸鼠血液中血管内皮生长因子(VEGF)的含量;⑥肿瘤组织HE染色,观察坏死情况,以LEICA Qwin图像分析系统计算各组肿瘤坏死率;⑦.免疫组化法测定各组肿瘤组织中微血管密度(MVD);⑧测量计算各组裸鼠肿瘤体积的大小以及肺转移率。结果1.Ad-VEGF-siRNA感染Hela细胞后,观察7天,未发现CPE;在各个时间点计数细胞,与未转染对照组相比,无统计学差异,两组细胞的生长曲线也基本一致。2.免疫组化按标准评分:两对照组中最低9分,Ad-VEGF-siRNA组中最高6分。A组与B、C组间统计分析差别有统计学意义,B、C组间统计分析差别没有统计学意义。3.①14天和26天A组裸鼠肿瘤组织中VEGF-mRNA的RQ平均值分别为0.088±0.024,0.075±0.026;B组裸鼠肿瘤组织中VEGF-mRNA的RQ平均值分别为0.179±0.103和0.167±0.065;C组裸鼠肿瘤组织中VEGF-mRNA的RQ平均值分别为0.185±0.085,0.183±0.128。统计学分析A组RQ平均值与其他两组的差别有意义(P＜0.05),而其他两组无差异(P＞0.05)。②14天和26天A组裸鼠血液中VEGF含量平均值(pg/ml)分别为247.023±10.563,193.749±7.920;B组裸鼠血液中VEGF含量平均值(pg/ml)分别为833.002±29.091和859.638±19.474;C组裸鼠血液中VEGF含量平均值(pg/ml)分别为823.245±9.286,831.987±29.510。统计学分析A组其他两组的差别有意义(P＜0.05),而B、C两组无差异(P＞0.05)。⑨各组裸鼠肿瘤的坏死率在14天时较低,26天时升高,但A、B、C各组间差别无统计学意义(P＞0.05)。④14天和26天各组裸鼠肿瘤的MVD值分别为A组:10.2±1.6,9.8±1.2;B组:18.4±1.8,23.4±1.4;C组:19.8±3.0,22.5±1.3。统计学检验在两个时间段A组与B、C两组间差别有统计学意义(P＜0.05),B、C两组无差异(P＞0.05)。⑤7天、14天、26天各组肿瘤体积的平均值(cm3)分别为:A组:0.147±0.143,0.492±0.151,0.527±0.186;B组:0.225±0.102,0.504±0.2761.021±0.769,;C组:0.185±0.109,0.514±0.390,0.904±0.484。7天、14天时各组体积无统计学差异,26天时A组与B、C两组间差别有统计学意义(P＜0.05),B、C两组无差异(P＞0.05)。计算抑瘤率为52.3％。⑥.大体观察每组裸鼠14天、26天的肺转移率(％)分别为A组:0％,20％;B组:20％,40％;C组:0％,40％。病理切片观察每组裸鼠14天、26天的肺转移率(％)分别为A组:0％,40％;B组:40％,60％;C组:20％,60％。结论 Ad-VEGF-siRNA能够转染MG63骨肉瘤细胞,抑制VEGF的表达;以静脉注入动物模型体内能引起靶肿瘤组织VEGF-mRNA的降解,下调血液中VEGF的含量,抑制肿瘤新生血管的生成,对骨肉瘤的生长和远处肺转移有治疗作用,但对肿瘤本身无直接杀伤作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词表

引言

第1章 Ad-VEGF-siRNA的制备

1.1 概述

1.2 实验材料与方法

1.3 实验结果

1.4 实验结论

第2章 Ad-VEGF-siRNA抑制骨肉瘤细胞VEGF表达的实验研究

2.1 概述

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 结论

第3章 Ad-VEGF-siRNA抑制骨肉瘤生长及其肺转移的实验研究

3.1 概述

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 结论

第4章 讨论

第5章 全文总结

致谢

参考文献

附录 文献综述

个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果”.