腺病毒介导的小鼠内皮抑素对荷骨肉瘤裸鼠肺转移抑制的研究

摘要

目的:通过自行构建腺病毒介导的小鼠内皮抑素并观察其在体内、外的表达及对肿瘤血管和荷骨肉瘤裸鼠肺转移的抑制作用,探讨内皮抑素表达水平与骨肉瘤肺转移的关系。
　　 方法:1、以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin基因,将mEndostatin基因连接到腺病毒载体PDC315中,构建PDC315-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过lipofecetamine2000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo,用氯化铯密度梯度超速离心法纯化,用50％组织培养感染剂量法测定病毒滴度。体外转染骨肉瘤细胞株MG-63,用western印迹检测感染的骨肉瘤细胞上清液mEndostatin的表达并通过鸡胚绒毛尿囊膜实验(CAM)观察其抑制血管形成的活性。2、建立荷骨肉瘤裸鼠动物模型:采用骨肉瘤细胞系MG-63,0.2ml细胞悬液(约1x106个细胞)/只注射到30只裸鼠右前肢皮下,一周后全部成瘤,随机分为3组:Ad-mEndo组(10只),Ad-EGFP组(10只),PBS组(10只)。另外以未接种肿瘤细胞的裸鼠(10只)作空白对照组。然后各组每周分别注射相应药物200ul/次,连续五次,最后抽血用免疫酶联吸附反应(ELISA)检测其内皮抑素表达水平;并用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径计算肿瘤体积,并于七周后处死观察有无肺转移。
　　 结果：1、扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为2.5×1010pfu/ml,体外能高效转染骨肉瘤细胞株,可分泌表达有抑制血管形成活性的mEndostatin。2、治疗结束后Ad-mEndo组肿瘤体积明显小于Ad-EGFP组和PBS组而其内皮抑素表达水平明显高于Ad-EGFP组和PBS组,并有显著性差异(P＜0.05)。同时观察三组裸鼠的肺脏发现Ad-mEndo组肺部未发现肿瘤转移灶,而其他两组裸鼠肺部可见大量散在转移灶,肺转移率＞70％。
　　 结论:腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因在体内、外均获得高效表达显著抑制了肿瘤血管生成和荷骨肉瘤裸鼠肺转移。证明了内皮抑素表达水平与肺转移有着直接的关系。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

前言

第一章 携带小鼠内皮抑素基因腺病毒载体的构建

引言

材料与方法

结果

第二章 内皮抑素腺病毒体外表达和血管抑制实验

材料与方法

结果

第三章 内皮抑素表达水平与骨肉瘤肺转移的关系

材料与方法

结果

第四章 实验讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录 基质金属蛋白酶及其抑制物与骨肉瘤侵袭转移的关系

个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果