热处理废弃重组质粒DNA的有效性与安全性分析

摘要

随着现代生物技术，特别是基因工程技术的高速发展，其对生态环境与人民健康可能造成的危害越来越引起人们的重视。生物实验室产生的废弃重组DNA片段的排放是造成重组DNA向自然界扩散的途径之一，并有可能导致“基因污染”，为此生物实验室含重组。DNA片段的废弃物一般需经预处理后排放。热处理是目前生物实验室处置废弃重组DNA片段、核酸等物质的主要手段。本文以pET-28b质粒为材料，采用定量PCR技术结合电泳和质粒转化等手段研究了重组DNA片段在热处理过程中的降解与失活规律及其影响因素，考察和分析了热处理(热变性)的重组质粒DNA在模拟水环境中的降解速率以及潜在的环境风险。研究结果将可初步确定热处理废弃重组DNA的有效性和安全性，并为今后建立系统的废弃重组DNA生态风险评价技术和标准提供参考价值和技术支撑。 实验结果显示，热处理过程中，由于高温和煮沸过程中剪切力的作用，pET-28b质粒DNA会发生解链和断裂，其降解半衰期约为2.7～4min，但30min后仍存在一级结构完整的质粒且仍具有3％～5％的转化活性。这表明热处理并不能彻底降解、破坏重组DNA片段，而主要使其解链变性。酸性条件能加速热处理过程中质粒DNA的降解，但环境中的离子强度、牛血清白蛋白(BSA)浓度、EDTA浓度都对热处理过程中的质粒DNA具有一定的保护作用，使其在热处理过程中的降解速率得到减缓，其中EDTA对热处理过程中质粒DNA的保护作用最强。由于生物实验室废水中通常含有上述有机或无机物质，因此实际热处理过程中质粒DNA的降解半衰期可能远长于2.7～4min，这一点必须引起我们高度关注。 研究发现，热变性的质粒DNA经过复性可在一定程度上恢复其转化活性，在一定范围内温度越高越利于热变性质粒的复性。因此热处理(变性)的质粒DNA进入生态系统后如不能在短时间内被彻底降解，理论上存在着复性并恢复转移活性的可能。然而研究发现进入水环境的热处理(变性)重组DNA在短时间内并不能被彻底降解。pH对热处理(变性)的质粒DNA在水环境中的降解有一定的影响，在pH值为5、6、9的情况下，经过55min的降解，便无法从水中检测到一级结构完整的质粒DNA的存在，其中pH为9时，热处理(变性)重组DNA在水环境中的降解速度最快。pH值为7和8时，水环境中的热处理(变性)质粒DNA降解速率相对较慢，到1.6h后才无法检测到一级结构完整的质粒DNA的存在。水环境中的离子强度对热处理(变性)质粒DNA有一定的保护作用，而且这种作用是随着离子强度的提高而增强。当水环境中NaCl浓度达到0.5％时，2.2h之后仍然能在定量PCR中检测到一级结构完整的质粒DNA。研究结果表明目前常用的废弃重组DNA沸水热处理手段难以彻底降解、破坏重组质粒DNA的一级结构(主要使质粒DNA变性)，并仍具有一定的转化活性。热变性的质粒DNA一定时间后能恢复生物活性，而且热处理后的重组质粒DNA进入水环境后在短时间内并未被彻底降解，因此这些热处理(变性)的重组DNA一旦进入生态系统后，理论上有足够的时间复性并可能发生基因转移，所以该热处理方法存在一定的安全隐患。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1现代生物技术带来的环境问题及其研究现状

1.1.1基因重组生物的安全性

1.1.2生物实验室安全性问题

1.2研究背景、意义以及研究内容和技术路线

1.2.1研究背景与意义

1.2.2研究内容

1.2.3技术路线

1.2.4课题来源

第2章热处理过程中质粒DNA的降解/变性规律

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1热处理过程中质粒DNA结构的时间变化规律

2.3.2热处理过程中质粒DNA残留转化活性的时间变化规律

2.3.3热处理过程中质粒DNA的降解速率与降解半衰期

2.4小结

第3章热处理过程中质粒DNA降解/变性的环境影响因素

3.1前言

3.2实验材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3实验结果与讨论

3.3.1 pH对质粒DNA热处理的影响

3.3.2 NaCl对质粒DNA热解过程的影响

3.3.3 BSA对质粒DNA热解的影响

3.3.4 EDTA对质粒DNA热解的影响

3.4小结

第4章热处理重组质粒DNA的复性及其在模拟水环境中的降解

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1热处理质粒DNA的复性效率

4.3.2热变性质粒DNA在不同pH水环境中的降解与残留时间

4.3.3水环境中的离子强度对热变性质粒降解的影响

4.4小结

第5章结论与建议

5.1结论

5.2建议

致谢

参考文献

个人简介 在读期间发表的学术论文与研究成果