发菜麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

摘要

海藻糖代谢途径及其相关代谢酶的研究一直是生物工程研究的重点和热点。不论从理论研究还是应用方面都显示出了明显的价值和意义。发状念珠藻具有很强的抗逆性，能抵御极端不良环境的胁迫。本实验室于2007年在受到干旱胁迫的发状念珠藻中发现了海藻糖的存在，本研究进一步对其体内海藻糖代谢与抗逆性之间的关系做了一些探索。
　　 本研究通过设计简并引物，从发状念珠藻(Nostoc flagelliforme Born.Et Flah.)中克隆得到一个基因组DNA片段，可能编码参与海藻糖代谢的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(NfMTS)。NfMTS基因全长2799bp，编码933个氨基酸，表达形成一个106.6KD大小的蛋白。该基因编码的氨基酸序列包含四个麦芽寡糖基海藻糖合成酶的高度保守区域。通过大肠杆菌中表达NfMTS，这个重组蛋白可以将麦芽糊精转化成麦芽糖基海藻糖，证明了这个蛋白具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶的功能。通过双倒数作图法得出该重组酶的米氏常数为1.87 mM(麦芽六糖为底物)，最适的酶活反应温度和pH分别为50℃和7.0。在干旱胁迫下，发状念珠藻中的海藻糖和蔗糖的积累量都显著升高，麦芽糖基海藻糖合成酶的表达量也呈现增加的趋势。然而，海藻糖积累得比较少，约0.36 mg·g-1DW，而蔗糖积累的量较大，约为0.90 mg·g-1DW，这表明了海藻糖和蔗糖在发状念珠藻的抗干旱胁迫中都起到了作用，同时，可能是蔗糖而不是海藻糖在发状念珠藻遇到干旱胁迫时作为化学伴侣分子起到了作用。
　　 本研究从分子水平研究了发菜海藻糖代谢途径中的关键酶，所得到的成果为研究发菜海藻糖代谢途径提供了一定的基础，也有利于我们深入了解发菜中海藻糖的代谢及功能。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.绪论

1.1发状念珠藻概述

1.2海藻糖概述

1.3发状念珠藻中海藻糖的研究

2.材料和方法

2.1材料

2.2方法

2.3技术路线

3.结果与分析

3.1发菜总DNA的提取

3.2 TreY基因片段的克隆

3.3生物信息学分析

3.4 pET32B-TreY基因在大肠杆菌中的表达

3.5 pET32B-TreY重组蛋白的纯化

3.6 TreY基因产物的酶活性测定

3.7米氏常数测定

3.8 TreY-mian基因的克隆、表达及纯化

3.9发菜中TreY表达量及海藻糖、蔗糖的测定

4.讨论

5.总结与展望

5.1生物信息学分析

5.2 NfMTS基因的鉴定和性质分析

5.3高压液相蒸发光测定糖类的应用

5.4 MTS基因的敲除

5.5代谢途径中的三个基因

参考文献

致 谢

攻读学位期间的研究成果