产亚硝酸盐还原酶短乳杆菌发酵条件优化及酶的分离纯化研究

摘要

亚硝酸盐作为氮循环的中间产物，广泛存在于自然界中，是潜在的致癌物质，在多数食品中均有检出。尤其在蔬菜中含量较高，是硝酸盐的细菌还原产物；亚硝酸盐具有防腐和增强风味的作用，作为添加剂加到肉制品。近年来，亚硝酸盐含量超标已对食品、水质、养殖和环境等造成了不同程度的危害，人们极力寻找有效控制或降解亚硝酸盐的方法。乳酸菌是人体益生菌，可产生亚硝酸盐还原酶，利用生物酶法降解亚硝酸盐是一种安全有效的新方法。
　　 本文利用实验室前期筛选并鉴定的一株产亚硝酸盐还原酶的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，通过优化培养基和发酵条件使产酶量提高，并从菌体中分离提取到该酶，同时研究了NiRs的部分酶学性质，另外，还对亚硝酸盐还原酶降解腌制蔬菜和肉制品中残留亚硝酸钠的情况进行了初步研究。主要研究结果如下：通过营养条件优化提高了产酶能力，酶浓度达1827.4 U/mL，与优化前的酶浓度1353.4 U/mL提高了35.06％。进一步对其发酵条件进行优化，得到发酵条件为：发酵液初始pH值6.42、接种量5.6％、添加量119μg/mL、30.5℃培养。综合两次优化的最优条件，亚硝酸还原酶的酶浓度为达到2139.2 U/mL，比优化前高出58.06％，比一次优化后高出17.59％。粗酶液经过盐析、微滤、透析、DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-150凝胶层析等分离纯化步骤，使NiRs的专性酶活达到1334.06 U/mg，比粗酶液提高了5.14倍。对亚硝酸盐还原酶的部分酶学性质进行研究，得出酶反应的适宜温度为28-35℃，最适温度为30℃；酶的热稳定性不好，温度超过40℃，酶活性即损失87.5％。酶的反应最适pH为5.5，从酸碱对酶的影响曲线来看，该酶是一种酸性酶。NiRs的Km值为120.52μg/mL。金属离子对酶的影响实验结果表明：低离子浓度时，Al3+、Cu2+、Fe2+和Fe3+能提高酶活力；Ba2+、Ag+、Cd2+、Mg2+和Ca2+对酶活力有抑制作用；Zn2+和K+对酶活力影响不大；高离子浓度时，Al3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和K+能提高酶活力；Zn2+、Ba2+、Ag+、Cd2+、Mg2+和Ca2+对酶活力有抑制作用，其中Cu2+促进影响酶活的最适浓度为5mmol/L。NiRs中所含微量金属元素为Cu和Fe，浓度分别为552.4 mg/Kg和113.2mg/Kg。SDS-PAGE测得分子量为41.83kDa。将酶添加到一些硝酸盐含量超标食品中，在最适反应条件下，经过12h亚硝酸盐含量可以降低到国家安全标准以下。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1引言

2亚硝酸盐对人体的危害及来源

2.1亚硝酸盐对人体的危害

2.2亚硝酸盐的来源

3减小亚硝酸盐危害的方法

3.1化学方法

3.2生物降解法

3.3酶处理法

4亚硝酸盐还原酶的研究现状

4.1 NiRs分类

4.2 NiRs性质

4.3 NiRs的分离纯化与结构

4.4 NiRs结构基因

5课题选题依据与研究内容

5.1课题来源

5.2课题研究意义

5.3课题研究内容

5.4解决的关键问题

5.5实验采取的技术路线和方法

5.6预期目标

第二章短乳杆菌产酶培养基成分及发酵条件的优化

1引言

2菌种、材料、仪器及培养基

2.1菌种

2.2试剂与耗材

2.3仪器

2.4培养基

3实验方法

3.1 NiRs酶活测定方法

3.2培养基营养成分单因素实验

3.3营养条件响应面优化实验

3.4培养条件单因素实验

3.5培养条件响应面优化实验

4结果与分析

4.1亚硝酸钠标准曲线的绘制

4.2营养条件单因素实验结果分析

4.3营养条件响应面优化实验结果分析

4.4培养条件单因素实验结果

4.5培养条件响应面优化实验结果分析

5本章小结

第三章 短乳杆菌中亚硝酸盐还原酶的分离提纯

1引言

2材料与仪器

2.1试剂与耗材

2.2仪器

3实验方法

3.1制作蛋白质标准曲线-紫外吸收法

3.2粗酶液的制备

3.3 NiRs纯化

4实验结果和分析

4.1蛋白质标准曲线

4.2粗酶制备结果

4.3分离纯化结果

5本章小结

第四章 NiRs的性质及在食品中的初步应用

1引言

2试剂与仪器

2.1试剂

2.2仪器

3实验方法

3.1 NiRs最适温度实验

3.2 NiRs最适pH值实验

3.3 NiRs的Km值测定

3.4金属离子对酶的促进和抑制

3.5 NiRs中所含微量金属元素

3.6 NiRs的分子量测定

3.7 NiRs在食品中的初步应用

4结果与分析

4.1最适温度实验结果

4.2最适pH值实验结果

4.3 Km值的测定结果

4.4金属离子对NiRs的影响实验结果

4.5酶蛋白所含微量金属元素测定结果

4.6 NiRs分子量测定结果

4.7 NiRs在食品中的应用实验结果

5本章小结

第五章结论与展望

1结论

2展望

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果