基于DNA分子开关的核酸适体生物传感器的研究

摘要

DNA分子开关是一种DNA的组装体，它能在两个或多个状态中以可控的方式实现可逆的切换。能够引发其状态切换的外部刺激包括光、温度、压力、电磁场、化学环境的改变等因素。因此，DNA分子开关对温度、光致异构化、离子环境、蛋白结合作出响应时，会诱发状态切换。核酸适体是一类具有高特异性和亲和性的经体外筛选得到的寡链核苷酸，被视为理想的分子识别元件，并被广泛用于生物传感器。通过两者的优势结合，发展出的新型基于适体的生物传感器具有更高的灵敏度和更高的特异性，在疾病诊断以及蛋白质组学方面的研究有极大的应用价值。本论文的工作采用电化学以及表面增强拉曼技术作为主要检测手段，研制了三种基于DNA分子开关的对蛋白质或小分子目标物有特异性响应的适体生物传感器。具体的研究工作包括以下几个部分:
　　 1.一种基于导电型开关的三路结合式溶菌酶适体传感器
　　 发展了一种基于适体互补探针(cDNA)由目标物结合诱导的构象变化的、具有三路结合(TWJ)结构的溶菌酶适体传感器。标记有二茂铁(Fc)的cDNA与溶菌酶适体部分杂交，形成一个折叠的结构，在这种结构中两个螺旋同轴堆砌，而第三个螺旋处于锐角位置。当不存在溶菌酶时，同轴螺旋中的导电通道可进行电子转移(eT)，即标记端的Fc能和电极发生电子转移。而溶菌酶和适体的结合会阻碍eT，导致Fc氧化还原的信号降低。这种适体传感器具有一个显著的信号衰减因子，检测限为0.2 nM，动力学范围至100 nM。相比于现有的基于电化学阻抗谱(EIS)的方法，TWJ适体传感器具有更好的特异性，以及更简便的再生程序。
　　 2.电极支持脂质双层膜上基于适体检测ATP
　　 研究提出了一种基于核酸适体的在电极支持脂质双层膜上无标记检测ATP的生物传感方法。这种电化学检测方法的作用机理是适体结合所致的变构能够调制导电通道中的电子转移，从而产生可变的电化学信号。它具有较高的灵敏度和稳定性，而且可以重复使用。其检测限估算值为50.1 nM，动态响应范围至3.2μM，检测范围覆盖了生物体细胞裂解液中ATP的含量0.1～1μM，能够满足实际检测的需求。随着纳米合成技术的进步，我们希望这种方法能够运用在亚微米级的电极甚至是纳米级的探针上，以便对单个细胞进行细胞内环境的监测。
　　 3.一种基于三螺旋开关的表面增强拉曼适体传感器。
　　 研究了一种灵敏的利用表面增强拉曼光谱(SERS)检测细胞色素c的方法，其原理是利用信号传导探针(STP)与目标物结合会发生构象变化。标记有X-罗丹明(ROX)的STP被固定在SERS基底上，与适体所形成的刚性的三螺旋开关结构可以阻止标记分子ROX的SERS增强。而目标物的结合却可以引发吸附在金表面ROX的拉曼强度的增强。该方法的检测限为2nM（相当于5μL样品中含有10 fmol被测物）。传感器对细胞色素c有非常好的特异性，某些干扰蛋白，诸如血红蛋白和免疫球蛋白G不干扰细胞色素c的测定。这一方法的设计策略有望拓展至更多的适体或DNA传感器。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 DNA分子开关

1．1．1 前言

1．1．2 DNA分子开关的种类

1．2 DNA分子开关与核酸适体的融合以及其在生物学中的应用

1．2．1 核酸适体

1．2．2 诊断和传感器

1．3 本文构思

第2章 基于导电型开关的三路结合式溶菌酶适体传感器

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与材料

2．2．2 适体传感器的组装

2．2．3 二茂铁标记到cDNA

2．2．4 电化学测试

2．2．5 传感界面的再生

2．3 结果与讨论

2．3．1 TWJ-DNA的结构的形成

2．3．2 cDNA1表面密度对传感的影响

2．3．3 TWJ-DNA适体传感器的特性

2．3．4 适体传感器对溶菌酶的响应

2．3．5 适体传感器的特异性

2．3．6 适体传感器的稳定性和重现性

2．4 本章小结

第3章 电极支持脂质双层膜上基于适体的ATP检测方法

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与材料

3．2．2 电极的制备

3．2．3 电化学测试

3．3 结果与讨论

3．3．1 实验原理

3．3．2 底液的选择

3．3．3 孵化时间对电极响应的影响

3．3．4 底液pH对CV的影响

3．3．5 底液浓度的影响

3．3．6 MB在LB／ME上的作用机理

3．3．7 ATP检测

3．4 本章小结

第4章 基于三螺旋开关的表面增强拉曼适体传感器检测细胞色素c

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与材料

4．2．2 金纳米颗粒基底的制备

4．2．3 STP-适体结合物的固定

4．2．4 传感界面的再生

4．2．5 STP表面密度的测量

4．2．6 拉曼测试

4．3 结果与讨论

4．3．1 检测原理

4．3．2 特征增强场的尺寸

4．3．3 STP链长度的影响

4．3．4 STP表面密度对传感的影响

4．3．5 自组装层对SERS响应的影响

4．3．6 定量检测以及选择性测试

4．4 本章小结

参考文献

致谢

附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录

声明