基于三链DNA分子开关的电化学生物传感器研究

摘要

DNA分子开关是核酸分子的组装体，可在两种状态中以可控的方式实现可逆切换，主要是靶标分子和外界环境（温度、pH和光等）因素诱发其状态切换。基于此，DNA分子开关被广泛的用于生物传感器的研发与设计，比如基于单链DNA分子开关和双链DNA分子开关的电化学生物传感研究。此类电化学传感器具有高效、快速、简易等优点，然而，这些DNA分子开关在设计应用时也存在一定缺陷，其中单链DNA分子开关大多需要对识别元件进行信号标记，进而将影响识别探针的特异性与亲和力。同时由于单链DNA具有柔软而松散的无规则特性，导致背景信号稳定性较差。双链DNA分子开关一定程度上克服了部分上述缺点，但存在分子开关状态可逆性切换困难。为了解决上述的策略设计固有缺陷，我们寄希望于特殊构型的三链DNA分子开关。三链DNA的构型是基于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对原理，同时将第三条DNA链通过氢键作用特异地结合在双链DNA的大沟中，平行或反平行缠绕在一起形成三螺旋结构。该设计既可以有效地避免对识别探针进行标记，紧密的刚性结构也可以提高背景信号稳定性，降低背景。另外，可以通过改变离子浓度或者溶液pH，调控切换DNA分子开关状态。因此，本论文基于三链DNA分子开关的特殊构型性质，构建电化学生物传感器用于分析检测生物分子，主要开展以下研究工作:
　　一、基于核酸适体与靶标结合诱导三链形成构建电化学生物传感平台
　　本文通过核酸适配体与靶标结合诱导形成三链DNA分子信号开关，构建了一种简便、灵敏的电化学生物传感平台。该生物传感平台包含三个部分:两端末尾分别修饰有亚甲基蓝(MB)与巯基的信号报告探针(STP)，目标核酸适配体探针(Apt)以及富含嘌呤碱基的三链形成探针(TFO)。首先，STP两端分别与TFO以及Apt杂交形成双链，通过Au-S键修饰到金电极表面上，由于DNA双链具有刚性结构，使STP上标记的电信号分子MB远离电极，电信号较小，当目标物存在时，由于目标物与Apt的识别作用，Apt远离电极表面，进而诱导STP与TFO形成三链结构，使MB靠近电极表面，此时电信号显著增强。本研究以凝血酶(Tmb)以及三磷酸腺苷(ATP)作为模式目标物用来证明该传感平台的可行性，其检测限分别为0.86nM和7.2nM。实验结果说明该方法有望作为一种通用的电化学生物传感平台广泛应用于其它生物分子的检测。
　　二、基于三链DNA分子开关和聚合酶循环放大电化学检测DNA
　　利用三链DNA分子开关具备识别元件免标记和利于降低背景信号等优势，联合Bst聚合酶的循环放大策略，发展了一种特异性强和灵敏度高的DNA分子电化学检测方法。该三链DNA分子开关由两部分组成:一部分是信号报告探针A链，该链富含嘌呤碱基，同时5'端和3'端分别修饰有巯基和MB。另外一部分是识别元件探针(HP)，该链由两端颈部富含嘧啶碱基和中间环部为与靶标DNA(T链)碱基互补配对序列构成。基于Watson-Crick和Hoogsteen的碱基互补原理，A链可与HP形成稳定的三链DNA分子结构，并通过Au-S键修饰到金电极表面。由于其刚性结构，三链DNA分子开关闭合，电信号分子MB远离电极，处于“eToff”状态。当T链存在时，T链与HP结合，使HP从电极上游离出来，分子开关打开，MB靠近电极，信号恢复，处于“eTon”状态。同时，游离出来的HP末端可与引物DNA（P链）互补杂交，并在聚合酶的作用下，P链不断延伸并与HP互补配对，将已经连接了的T链竞争下来。而被竞争下来的T链可进一步与未打开的三链DNA作用，实现T链的循环放大检测，其检测限为30pM。

目录

声明

摘要

本文常用英丈缩略词表

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 DNA分子开关

1．2．1 DNA分子开关的概述

1．2．2 DNA分子开关的分类

1．3 电化学生物传感器

1．3．1 电化学生物传感器的概述

1．3．2 电化学生物传感器的分类

1．3．3 三链DNA分子开关在电化学生物传感的应用

1．4 本文拟开展工作

第2章 基于核酸适体与靶标结合诱导三链形成构建电化学生物传感平台

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂和仪器

2．2．2 STP／Apt-TFO分子开关制备

2．2．3 金电极的预处理

2．2．4 工作电极的修饰

2．2．5 电化学检测Tmb和ATP

2．2．6 核酸适配体电化学传感平台的重复性

2．3 结果与讨论

2．3．1 检测原理

2．3．2 电极修饰的表征

2．3．3 实验可行性的考察

2．3．4 实验条件的优化

2．3．5 Tmb的电化学检测与选择性

2．3．6 ATP的电化学检测与选择性

2．3．7 生物传感平台重复性考察

2．4 小结

第3章 基于三链DNA分子开关和聚合酶循环放大电化学检测DNA

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 主要试剂和仪器

3．2．2 AH-THDNA分子开关的形成

3．2．3 工作电极预处理与修饰

3．2．4 Bst DNA聚合酶循环放大

3．2．5 电化学检测DNA

3．3 结果与讨论

3．3．1 实验原理

3．3．2 电极修饰的表征

3．3．3 实验可行性的考察

3．3．4 实验条件的优化

3．3．5 目标物DNA分子的检测

3．3．6 选择性实验

3．4 小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的学术论文目录

致谢