发状念珠藻在不同pH生长状态下的蛋白质组学分析

摘要

发状念珠藻（Nostoccommunevar.flagelliforme）又被称为发菜，分布于我国西部高海拔沙漠化土壤环境中，作为一种陆生蓝藻它具有极强的生存能力。根据目前的研究结果和文献报道，之所以原值体发状念珠藻能够适应各种极端环境条件的胁迫，究其原因是因为发状念珠藻能分泌具有一定分子结构的多糖类物质，这种物质在藻细胞外形成一层公共胶质鞘，从而帮助植物体适应各种环境如:干旱、寒冷、盐碱和强光。其中从生态学背景角度来看，土壤中的酸碱度对发菜的生长和分布具有重要影响。在自然条件下，发状念珠藻原值体偏向生活于相对较为盐碱性的土壤中。而脱去外层胶壳并且经过纯化的丝状藻体却具有广泛酸碱适应性。已有文献和研究报道，在偏碱性的条件下液体培养的发状念珠藻相对于其他pH条件可以分泌较多的胞外多糖类物质(EPS)，在本实验的研究过程也观察到了类似的现象。然而发状念珠藻原值体年增长率仅有6％生长缓慢，而且作为一级保护植物，这些因素似乎不利于进一步的开发利用这一植物资源，然而念珠藻作为蓝藻兼有细菌和植物的特点，有研究者研究发现液体悬浮培养方法能显著提高生物量进而提高胞外多糖分泌，从而解决生长缓慢，胞外多糖提取困难的缺点，本研究主要围绕以下两个方面进行研究:
　　(1)对不同时期的胞外多糖分泌进行定量统计，同时利用叶绿素荧光调制技术解释不同pH生境条件下藻体的生存策略。
　　(2)利用比较蛋白质组学和串联质谱对重悬于碱性条件的藻细胞进行了研究，期望对胞外多糖的代谢通路和分泌机制进行解释。分别对pH7.5和pH9.0两组6张双向胶图进行了分析得到了7个相对表达量大于两倍的蛋白质点，其中在这7个蛋白质点中，有两个蛋白质表达量的变化与培养液pH变化有极高的相关性，他们分别是有关细胞外膜形成和胞外多糖分泌过程的PP2C型磷酸蛋白酶和二氨基庚二酸(Diaminopimelate)异构酶。这份研究同时也得到3个未知蛋白，他们在蓝藻中并未发现相关信息。
　　本研究中得到的PP2C型磷酸蛋白酶与念珠藻细胞胞外多糖分泌和氮固定过程紧密相连，相对于对照组表达量下降2.5倍，同时参与细胞外膜形成的二氨基庚二酸(Diaminopimelate)异构酶表达量上升了5.2倍，这个结果也许表明在碱性环境中细胞培养物倾向于合成较厚的细胞外膜，间接的证明了胞外多糖分泌过程是和细胞内某些代谢通路紧密相连，为进一步研究发状念珠藻胞外多糖分泌过程提供了参照和依据。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 多糖类物质

1．1．1 生物多糖类物质

1．1．2 植物多糖的生物活性及其应用

1．1．3 微生物多糖

1．1．4 蓝藻胞外多糖的分泌途径

1．2 发状念珠藻

1．2．1 发状念珠藻的形态学特征及其分布

1．2．2 发状念珠藻原值体的人工培养

1．2．3 藻类相应环境胁迫蛋白质组学研究进展

1．3 发状念珠藻的抗逆研究

1．3．1 发状念珠藻的应用

1．4 研究工作的内容，目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验中药品和试剂

2．1．3 其它常用国产分析纯试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．2 方法

2．2．1 发状念珠藻的纯化培养和保种方法

2．2．2 分子克隆

2．2．3 发状念珠藻细胞生理参数

2．2．4 发状念珠藻蛋白分析技术

第三章 实验结果与讨论

3．1 发状念珠藻液体悬浮培养物的生理状态及生长特性

3．1．1 发状念珠藻液体悬浮培养物的发育形态

3．1．2 发状念珠藻液体悬浮培养物在不同pH条件下的荧光参数

3．1．3 不同pH条件下发状念珠藻的生长状态

3．2 发状念珠藻可溶性蛋白质二维电泳及蛋白质鉴定

3．2．1 总可溶性蛋白质的表达谱分析

3．3 差异表达的发状念珠藻蛋白质功能分析

3．3．1 差异表达的发状念珠藻蛋白质功能特征

3．4 不同pH培养条件对重悬培养的藻细胞外多糖分泌的影响

第四章 分析

4．1 分子量和等电点差异

4．2 分析与比对差异蛋白质点

4．3 关于胶图分析过程中的问题

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果

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