制备HPLC法分离纯化桦褐孔菌醇的研究

摘要

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又称白桦茸，主要分布于东欧、俄罗斯和北美部分地区，我国黑龙江、吉林等地也有分布。其菌核用于治疗癌症、心脏病及糖尿病等。桦褐孔菌醇是其主要的活性成分之一。该物质是一种羊毛脂烷型的三萜类化合物，有抑制移植肿瘤的活性，并且对体外的肺癌、胃癌等多种癌细胞也有一定的抑制作用。目前市场上很少有商品化的高纯度标准品，这不仅限制了对其进一步的药理和药效学研究，也使得对已有的桦褐孔菌醇产品的质量分析产生困难。因此，本研究采用高效、快捷、符合制药工艺要求的制备HPLC法进行了高纯度的桦褐孔菌醇制备。 原材料桦褐孔菌菌核用95%的乙醇常温渗漉提取，得到28g乙醇提取物。提取物再分别用1050mL石油醚、2050mL乙酸乙酯依次萃取，乙酸乙酯萃取物用硅胶柱(2.6cm×30cm)粗分离，氯仿：甲醇=10:90洗脱去除极性杂质，再过C18柱层析（1cm×1cm）甲醇洗脱，吸附非极性杂质，得到HPLC制备前样品（3.37g），检测桦褐孔菌醇含量约为15%。制备分离条件研究用分析型色谱柱（Hypersil GOLD, C18反相柱，250×4.6mm，5μm，）进行，测试了75%的乙腈，70%-90%的甲醇-水溶液对桦褐孔菌醇及杂质的分离效果；测试了流速（0.6-1.0mL/min）、进样体积（20-1100μL）对制备分离的影响作用。在权衡上样量和纯度后，选取90%的甲醇为流动相，0.8mL/min的流速的条件进行线性放大计算，在到制备型色谱柱中（SinoChrom ODS-BP,15μm，300mm×40.0mm），以流速为32mL/min、进样量为4mL进行分离，收集保留时间为40-45min的馏分160mL。得到含桦褐孔菌醇纯度为57.09%的样品。该馏分再次进制备柱进行再次分离，分别用蒸发光散射检测器（漂移管温度32℃，气体流量0.5mL/min)和光电二极管阵列检测器（190-360nm）检测，纯度分别为99%和97%。 制备得到的桦褐孔菌醇用高、低分辨ESI质谱、1H-NMR、13C-NMR进行鉴定和表征。低分辨质谱测得该分离物的分子离子峰m/z为425.4（M+H-H2O）、407.4（M+H-2H2O）和443.3（M+H）；低分辨质谱中m/z为425.4的分子离子峰用高分辨质谱进行分析确认得到的m/z为425.3772（M+H-H2O），经过数据库比对得到该结构为C30H49O，与桦褐孔菌醇的分子式一致。1H-NMR(500MHz CDCl3)在高场区可见四环三萜类化合物典型的五个角甲基尖峰δ0.75（3H,s）、0.81（3H,s）、0.87（3H,s）、0.98（3H,s）和1.00（3H,s），13C-NMR(500MHz CDCl3)、DEPT和COSY结果显示的碳原子的个数与化学位移均与已报导的桦褐孔菌醇相符，因此，确认为制备得到的为桦褐孔菌醇。 本研究用制备HPLC获得了高纯度的桦褐孔菌醇，可为桦褐孔菌相关产品质量分析和检测提供标准品，并为进一步工业化制备桦褐孔菌醇提供了理论和实验基础。

目录

第1章 绪论

1.1桦褐孔菌(Inonotus obliquus)

1.1.1桦褐孔菌(Inonotus obliquus)的分布及形态特征

1.1.2桦褐孔菌(Inonotus obliquus)的活性成分

1.1.3 桦褐孔菌的药理活性

1.2 桦褐孔菌醇（inotodiol）的理化性质和提取分离纯化

1.2.1 桦褐孔菌醇（inotodiol）的化学结构

1.2.2 桦褐孔菌醇（inotodiol）药理活性

1.2.3 桦褐孔菌醇的提取和分离纯化

1.2.3 桦褐孔菌醇（inotodiol）的分离纯化

1.3 制备型 HPLC法及其在相关领域的应用

1.3.1 制备型HPLC法

1.3.2 制备型高效液相色谱法的分离成本

1.3.3 制备型高效液相色谱法的线性放大

1.3.4 制备型HPLC法在生物及医药领域的应用

1.4 本课题的立题依据及研究的目的与意义

第2章 材料与方法

2.1 材料、试剂与仪器

2.1.1 主要仪器及材料

2.1.2 主要试剂

2.2 桦褐孔菌醇（inotodiol）样品的提取

2.2.1桦褐孔菌（Inonotus obliquus）提取物的制备[84-92]

2.3. 硅胶柱精制条件研究

2.3.1硅胶柱洗脱条件研究

2.3.2 桦褐孔菌醇的玻璃柱放大的分离纯化

2.3.3 硅胶柱层析分离纯化桦褐孔菌醇

2.4 固相萃取小柱（SPE）分离纯化

2.4.1.固相小柱萃取SPE(Solid Phase Extraction)

2.5 桦褐孔菌醇（inotodiol）HPLC条件研究

2.5.1色谱条件

2.5.2流动相研究

2.5.3 流动相流速的研究

2.5.4 进样体积的选择

2.5.5 线性放大

第3章 结果与讨论

3.1 桦褐孔菌醇（inotodiol）的提取

3.1.1 桦褐孔菌醇的粗提取

3.1.2 硅胶柱分离条件的研究

3.2 固相萃取小柱（SPE）分离纯化

3.3 HPLC分离条件优化

3.3 .1流动相条件的研究

3.3 .2流动相流速的研究

3.3 .3进样量的选择

3.3.4 制备型高效液相色谱的制备

3.3.5 桦褐孔菌醇的纯品制备

3.3.6 桦褐孔菌醇（inotodio l）的结构鉴定

第四章 总结

参考文献

致谢