红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶超家族基因的克隆及分析

摘要

黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的次生代谢产物，对于植物的自身防御和生理调节具有重要的作用。黄酮类化合物还具有抗氧化、抑菌消炎、抑制肿瘤细胞活性、抗HIV活性等功能，且毒性较小，药用价值较高。种子植物中黄酮代谢途径已研究的较为清楚。蕨类是一类黄酮含量较高的植物类群，但其黄酮代谢途径尚不清楚。CHS是黄酮合成途径中的第一个关键酶，在植物黄酮代谢中发挥着重要作用。漫长的进化过程中，CHS基因在不同植物谱系中发生了不同程度的重复和分化，导致在多数植物基因组中出现由CHS基因分化形成的 CHSlike基因，组成了查尔酮合成酶基因超家族(Chalcone synthase superfamily)。到目前为止已在种子、蕨类，苔藓植物中分离到多种查尔酮合成酶超家族基因，但在蕨类植物中查尔酮合成酶超家族基因的种类及功能尚不明确。研究蕨类植物中查尔酮合成酶超家族基因，对阐明黄酮代谢途径的分子机制，揭示查尔酮合成酶超家族基因的功能及其演化均具有重要的科学意义。 本研究以红盖鳞毛蕨为实验材料，应用转录组测序、PCR及高效液相色谱技术对查尔酮合成酶超家族基因进行克隆、表达分析及功能研究，并对该基因序列进行了生物信息学分析。本研究的实验结果主要有以下几个方面： 1.利用Ilumina Hiseq2000平台对红盖鳞毛蕨拳卷叶进行测序，获得8.5G数据量。对获得的数据进行组装拼接，共获得Unigene143604条。依据注释结果分析获得CHS可能性基因28条，经分析选取其中4条作为CHS的候选基因。 2.根据转录组测序技术，成功克隆到四条CHS候选基因的ORF序列，将该四条基因序列重新命名为：DeCHS、DeCHSlike1、DeCHSlike2和DeCHSlike3。生物信息学分析表明，DeCHS的ORF全长1212bp，编码403个氨基酸；DeCHSlike1的ORF全长1371bp，编码456个氨基酸；DeCHSlike2的ORF全长1506bp，编码501个氨基酸；DeCHSlike3的ORF全长1332bp，编码443个氨基酸。 3.运用 In-fusion连接技术，成功构建四条 CHS的重组质粒 pET28a-DeCHS、pET28a-DeCHSlike1、pET32a-DeCHSlike2、pET32a-DeCHSlike3。将重组质粒导入到BL21感受态细胞中构建原核表达载体，并用IPTG诱导获得融合蛋白，经SDS-PAGE鉴定获得蛋白大小分别为44.2KD、48.3 kDa、68.5 kDa、64.6 kDa，与预期的蛋白大小相一致。 4.本研究以丙二酰CoA、香豆酰CoA、苯乙酰CoA、乙酰CoA和异戊酰 CoA为底物，分别采用四条基因表达的融合蛋白对底物进行催化，对催化产物进行高效液相色谱（ HPLC）检测，结果表明：DeCHS蛋白既能催化香豆酰CoA和丙二酰CoA反应也能催化苯乙酰CoA和丙二酰CoA反应产生柚皮素，和已报道的植物CHS基因功能一致。DeCHSlike1蛋白可催化香豆酰CoA和丙二酰CoA反应产生柚皮素，但不能催化苯乙酰CoA和丙二酰CoA反应。在以乙酰CoA、异戊酰CoA和丙二酰CoA反应时均能产生产物，但产物未知。DeCHSlike2、DeCHSlike3蛋白可催化香豆酰CoA、苯乙酰CoA和丙二酰CoA反应产生柚皮素；也可催化异戊酰CoA和丙二酰CoA反应产生6-异丁基-4-羟基-2-吡喃酮，但以乙酰CoA和丙二酰CoA作为底物时，产物不同，因此二者在功能上存在差异，需要进一步探究。 本研究发现红盖鳞毛蕨具有不同类型的CHS基因，但其功能尚未产生明显的分化。经分析DeCHS与已报道的植物CHS基因功能相同；DeCHSlike1既具有CHS基因功能也具有CHSlike基因的功能；DeCHSlike2、DeCHSlike3可催化异戊酰CoA和丙二酰CoA反应产生中间产物6-异丁基-4-羟基-2-吡喃酮，具有VPS的功能，表明DeCHSlike2和DeCHSlike3均为CHSlike类型。综上所述，红盖鳞毛蕨中具有查尔酮合成酶超家族基因。

目录

第一章前言

1.1蕨类植物概述

1.1.1蕨类植物的分布及功能

1.1.2蕨类植物基因组及转录组相关研究进展

1.1.3蕨类植物的各项利用价值

1.1.4红盖鳞毛蕨

1.2.1黄酮类化合物的结构与功能

1.2.2黄酮类化合物的生物合成途径

1.2.3黄酮合成途径中的关键酶基因研究进展

1.3查尔酮合成酶超家族基因研究进展

1.3.1查尔酮合成酶超家族基因的结构

1.3.2查尔酮合成酶超家族功能及其次生代谢产物

1.4本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1.1实验材料

2.2.2实验使用设备

2.2.1转录组测序

2.2.2 DeCHS基因的克隆

2.2.3 DeCHS超家族基因原核表达载体的构建

2.2.4 红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶超家族基因目的蛋白表达

2.2.5重组质粒pDest37-4CL的诱导表达及体外酶活反应

2.2.6 DeCHS基因编码蛋白体外酶活检测

第三章实验结果

3.1.1红盖鳞毛蕨RNA提取

3.1.2转录组测序

3.1.3转录组测序结果中与查尔酮合成酶超家族相关的基因

3.2查尔酮合成酶超家族基因ORF序列的获得

3.3 红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶 DeCHS、DeCHSlike1、DeCHSlike2、DeCHSlike3基因的生物信息学分析

3.3.1红盖鳞毛蕨DeCHS基因的ORF序列分析

3.3.2红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶超家族中的DeCHSlike1基因的ORF序列分析

3.3.3红盖鳞毛蕨DeCHSlike2基因的ORF序列分析

3.3.4红盖鳞毛蕨DeCHSlike3基因的ORF序列分析

3.4构建进化树聚类分析

3.5 查 尔 酮 合 成 酶 超 家 族 基 因 DeCHS 、 DeCHSlike1—DeCHSlike3原核表达载体构建

3.6 重组质粒 pET32a-DeCHS、pET32a-DeCHSlike1、pET32a-DeCHSlike2及pET32a-DeCHSlike3的蛋白诱导表达及纯化

3.6.1目的蛋白诱导表达

3.6.2目的蛋白纯化

3.7重组质粒pDest37-4CL的诱导表达

3.8查尔酮合成酶超家族基因编码蛋白的体外酶活检测

3.8.1以丙二酰CoA和香豆酰CoA为底物的体外酶活检测

3.8.2以丙二酰CoA和苯乙酰CoA为底物的体外酶活检测

3.8.3以丙二酰CoA和乙酰CoA为底物的体外酶活检测

3.8.4以丙二酰CoA和异戊酰CoA为底物的体外酶活检测

3.9讨论

3.9.1 DeCHS基因及其进化的探讨

3.9.2查尔酮合成酶蛋白特性的探讨

3.9.3 DeCHS基因的原核表达及产物检测的探讨

第四章总结与展望

参考文献

致谢

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