衣原体碱基切除修复酶学性质研究

摘要

衣原体是一种严格胞内寄生病原微生物，可导致多种疾病。碱基切除修复是一种修复单碱基损伤的DNA修复系统。为了系统研究衣原体碱基切除修复酶学性质，本文克隆了参与衣原体碱基切除修复的8个基因(尿嘧啶DNA糖苷酶UDG、DNA糖苷酶MutY、DNA糖苷酶AlkA、内切核酸酶Ⅲ、内切核酸酶Ⅳ、DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶与单链特异性5'外切核酸酶RecJ)，并在大肠杆菌中进行重组表达。除DNA连接酶外，其它7个蛋白均成功表达。经Ni-NTA树脂与离子交换树脂两步纯化，得到6个可溶性蛋白(尿嘧啶DNA糖苷酶、DNA糖苷酶MutY、内切核酸酶Ⅲ、内切核酸酶Ⅳ、DNA聚合酶Ⅰ与单链特异性5'外切核酸酶RecJ)，研究了纯化蛋白的酶学性质。最后在体外成功构建了碱基切除修复系统，探讨了衣原体碱基切除修复可能的作用机制。得到如下结果。 衣原体尿嘧啶DNA糖苷酶UDG是一种单功能DNA糖苷酶，可以切除单链和双链DNA中的尿嘧啶碱基；无AP裂解酶(APlyase)活性，不能进一步切断产生的无碱基位点(AP位点)。衣原体UDG切除尿嘧啶的最适反应温度与pH分别为37℃与8.0。双链DNA中尿嘧啶的互补碱基影响衣原体UDG糖苷酶活性，不同碱基对的切割效率为：U/-＞U/T＞U/C＞U/G＞U/A。衣原体UDG酶活性受尿嘧啶与AP位点的产物抑制作用。衣原体UDG的77位天冬氨酸与200位组氨酸是DNA糖苷酶活性的必需氨基酸，二者分别突变为天冬酰胺与谷氨酰胺后，酶活性几乎完全丧失。衣原体UDG的各种酶学性质表明其属于第一类尿嘧啶DNA糖苷酶。 衣原体内切核酸酶Ⅲ是一种典型的双功能DNA糖苷酶，可以切除DNA中氧化的胸腺嘧啶(胸腺嘧啶5，6二醇与尿素)，以及氧化的鸟嘌呤(8-oxo-G)；同时具有AP裂解酶活性。AP裂解酶在AP位点3'端切断双链DNA，产生带3'α，β不饱和醛与5'磷酸的缺口。 衣原体DNA糖苷酶MutY可以有效切除与鸟嘌呤或8-氧-鸟嘌呤(8-oxo-G)配对的腺嘌呤碱基，但没有明显的AP裂解酶活性。产物AP/8-oxo-G与MutY的结合力很强，不能被衣原体内切核酸酶Ⅲ的AP裂解酶活性与衣原体内切核酸酶Ⅳ的AP内切核酸酶活性所切断。 衣原体内切核酸Ⅳ是一种多功能DNA修复酶，具有AP内切核酸酶、3'修复酶、3'外切核酸酶三种活性。其中，AP内切核酸酶活性在AP位点5'端切断双链DNA和单链DNA，产生带3'羟基与5'脱氧核糖磷酸的缺口。3'修复酶活性可以除去3'末端阻碍DNA聚合酶延伸的α、β不饱和醛，产生自由羟基，用于DNA聚合酶催化的延伸反应。衣原体内切核酸酶Ⅳ还具有作用于双链DNA以及RNA/DNA杂合体RNA链(而非DNA链)的3'外切核酸酶活性。当双链DNA作为底物时，二价镁离子是活性必需离子，然而二价锌离子、铜离子与镍离子则完全抑制3'外切核酸酶活性；3'外切核酸酶活性的最适pH为8.0-10.5；高浓度NaCl抑制3'外切核酸酶活性。3'外切核酸酶可作用于双链DNA的3'平滑末端，3'凹陷末端与内部缺口的3'末端，以及3'突出端。双链DNA的3'末端核苷酸错配时，仍可被衣原体内切核酸酶Ⅳ的3'外切核酸酶活性有效降解，但错配核苷酸数多于三个时，降解效率极低；与此相一致，双链DNA3'突出端的核苷酸数目多于3个时，3'外切核酸酶很难水解突出的3'单链DNA。基于衣原体内切核酸酶Ⅳ特异性切割RNA/DNA杂合体的RNA链，我们提出了其3'外切核酸酶的作用机制：衣原体内切核酸酶Ⅳ3'外切核酸酶的活性中心由两个结构域构成，其中一个只结合DNA链，作为切割另一条DNA或RNA链的模板链；而被切割的DNA或RNA链只能结合在另一个结构域。 衣原体DNA聚合酶Ⅰ只具有DNA模板依赖性的DNA聚合酶与5'外切核酸酶活性，无3'外切核酸酶活性。其中，5'外切核酸酶活性可以从DNA的5'凹陷末端、内部缺口处的5'端降解DNA；也可降解内部缺口处的5'单链DNA(5'flap结构)。由于缺失了3'外切核酸酶活性，衣原体DNA聚合酶Ⅰ延伸3'末端核苷酸不配对的模板/引物复合体的能力大大降低。3'外切核酸酶活性的缺失使得衣原体DNA聚合酶Ⅰ跨越DNA模板中损伤碱基的能力大大增强，除了可以跨越次黄嘌呤、脱氧尿嘧啶与8-氧-鸟嘌呤外，衣原体DNA聚合酶Ⅰ还可以跨越脱氧核糖(52.5﹪)与四氢呋喃(87.5﹪)两种无碱基位点；而具有3'外切核酸酶活性的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ不能有效跨越脱氧核糖(1.2﹪)与四氢呋喃(12.4﹪)。与正常DNA模板相比，衣原体DNA聚合酶Ⅰ跨越次黄嘌呤、脱氧尿嘧啶与8-氧-鸟嘌呤的最大反应速率没有明显变化，但Km增大了60﹪；跨越两种AP位点的最大反应速率极大降低，且Km明显增高。由于衣原体基因组中只有DNA聚合酶Ⅲ与DNA聚合酶Ⅰ两种DNA聚合酶，因此DNA聚合酶Ⅰ很可能负责衣原体的跨越损伤合成，以使衣原体在极端恶劣的环境条件下存活。3'外切核酸酶活性的缺失使衣原体DNA聚合酶Ⅰ在DNA合成中丧失了校正功能。衣原体内切核酸酶Ⅳ的3'外切核酸酶活性可能互补DNA聚合酶Ⅰ缺失的3'外切核酸酶活性，负责DNA合成中3'端错配核苷酸的校正功能。 衣原体RecJ具有单链特异性的5'外切核酸酶活性，未检测到明显的5'脱氧核糖磷酸水解酶活性。 利用人工合成的中间含有一个U碱基的双链DNA作为底物，通过3种纯化的衣原体碱基切除修复重组蛋白(尿嘧啶DNA糖苷酶UDG、内切核酸酶Ⅳ、DNA聚合酶Ⅰ)与大肠杆菌DNA连接酶的共同作用，可以在体外进行碱基切除修复。衣原体单链特异性的5'外切核酸酶RecJ未表现出5'脱氧核糖磷酸水解酶活性，因而并未促进以单核苷酸延伸为特征的短补丁碱基切除修复；衣原体内切核酸酶Ⅲ具有一定的5'脱氧核糖磷酸水解酶活性，可以促进短补丁碱基切除修复。基于上述结果我们提出了一种短补丁碱基切除修复路径：单功能DNA糖苷酶切除损伤碱基；内切核酸酶Ⅲ的AP裂解酶活性在AP位点3'端切断DNA，产生带3'α，β不饱和醛与5'磷酸的缺口；内切核酸酶Ⅳ切除缺口处3'端的α，β不饱和醛，产生用于DNA聚合酶Ⅰ延伸的3'OH；DNA聚合酶延伸掺入一个核苷酸；最后DNA连接酶缝合缺口，完成修复。

目录

文摘

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绪论

第一章衣原体碱基切除修复蛋白表达纯化

第二章衣原体三种DNA糖苷酶UDG、内切核酸酶Ⅲ与MutY功能鉴定

1.前言

2.材料方法

3.结果

4.讨论

5.参考文献

第三章衣原体内切核酸酶Ⅳ功能鉴定

第四章衣原体DNA聚合酶Ⅰ功能鉴定

第五章衣原体碱基切除修复体外重组

第六章结论

第七章文献综述

1 DNA损伤与修复简介

2 核苷酸切除修复

3 碱基错配修复

4 跨越损伤合成

5 同源重组修复

6 非同源末端接合修复

7 碱基切除修复

8 衣原体生物学研究方法与进展

参考文献

致谢

攻读学位期间发表学术论文