化学发光与微纳分析方法联用研究

摘要

化学发光是指某些物质(包括产物)在化学反应中吸收反应过程中所释放的化学能,受激后从激发态回到基态时所产生的光辐射.由于化学发光检测系统光路简单,无需外加光源,不存在荧光分析中由于瑞利散射和拉曼散射及溶剂荧光杂质产生的背景信号,因而具有很高的信噪比,可获得与激光诱导荧光相媲美的高灵敏度.常用的化学发光反应大多数属于快速动力学反应,特别适合于微体积在线检测.然而,由于化学发光分析的选择性差,限制了它的实际应用. 本论文基于化学发光的高灵敏检测特性,微流控芯片的高效分离特点和荧光纳米晶体(量子点)的量子效应,旨在发展其联用方法,建立高灵敏、高选择性的分析新方法,用于生物分析,主要研究工作包括如下几个方面: 1.发展了玻璃芯片和硅橡胶(PDMS)/玻璃复合芯片制备工艺.系统地研究了化学刻蚀条件和芯片的封装工艺,利用发展的微加工技术,制备出PDMS/玻璃复合型微流控芯片和玻璃微流控芯片,同时对芯片电泳性能进行了考察.为发展微流控芯片的联用技术奠定了基础. 2.建立了高灵敏的化学发光检测系统,成功地实现了与微流控芯片联用.将化学发光一微流控芯片联用系统首次用于蛋白质等电点聚焦分析.建立了血色素蛋白质的高灵敏检测分析新方法.同时对化学发光检测模式以及两种不同材质芯片进行了比较.在优化的实验条件下,细胞色素c,肌红蛋白和过氧化物酶在玻璃芯片上10分钟内实现了很好的分离检测,其检测限(S/N=3)分别为1.2×10<'-7>,1.6×10<'-7>,和1.0×10<'-10> mol/L.细胞色素c的线性范围为2.5×1旷7到3.O×10.6 mol/t.俾=0.999.),过氧化物酶的线性范围为3/0×10<'-10>到4.0×10<'-9> mol/LR=0.994),细胞色素c以及过氧化物酶的迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别低于5.0﹪和10.0﹪(n=5).我们初步的实验结果表明芯片等电聚焦一化学发光检测是分离检测血色素蛋白质的有效方法. 3.发展了荧光量子点一生物标记物的纯化和表征新方法.通过实验我们发现超滤法是纯化量子点生物标记物的简单、有效的方法.通过选择合适滤膜和多次超滤步骤,碲化镉量子点一蛋白质的连接物(牛血清白蛋白及辣根过氧化物酶)的纯度达到90﹪以上.建立了以毛细管电泳一激光诱导荧光检测法表征量子点一蛋白质连接物的新方法.通过优化实验条件,游离量子点与其蛋白质连接物达到了有效分离.实验结果表明我们的方法是简单、有效的.同时我们发现量子点一蛋白质的连接物在水溶液中是稳定的.这些工作为荧光量子点的生物应用以及为本论文下一步的工作即化学发光检测和纳米技术联用奠定了基础. 4.基于荧光共振能量转移原理,提出了以化学发光物质为能量供体和量子点生物标记物为能量受体的化学发光共振能量转移新方法. 我们选择了辣根过氧化物酶催化鲁米诺一过氧化氢高灵敏的化学发光反应.设计了两种共振能量转移体系:(1)将不同尺寸的荧光量子点与辣根过氧化物酶连接,成功实现化学发光共振能量转移;(2)将不同尺寸的荧光量子点与牛血清白蛋白连接,牛血清白蛋白抗体与辣根过氧化物酶连接,利用抗原一抗体免疫反应实现化学发光共振能量转移.这种新方法能够应用于生物成像和均相免疫分析中.

目录

文摘

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第一章绪论

1.1化学发光

1.1.1化学发光研究的历史

1.1.2化学发光检测的基本原理

1.1.3化学发光反应类型

1.2化学发光与微分离分析方法联用研究

1.2.1毛细管电泳

1.2.2芯片毛细管电泳

1.2.3化学发光与毛细管电泳及芯片毛细管电泳联用

1.4.5 DNA

1.3本论文选题的思路

1.4参考文献

第二章微流控芯片的制备

引言

第一部分聚二甲基硅氧烷/玻璃复合型微流控芯片的制备

2.1.1实验部分

2.1.2结果与讨论

第二部分玻璃微流控芯片的制作及应用研究

2.2.1实验部分

2.2.2结果与讨论

2.3 结论

2.4参考文献

第三章芯片等电聚焦与化学发光检测联用研究

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1试剂

3.2.2芯片的制备

3.2.3仪器

3.2.4芯片等电聚焦

3.3结果与讨论

3.3.1用于芯片等电聚焦的两种化学发光检测模式

3.3.2化学发光反应条件优化

3.3.3用于等电聚焦的两种不同质材芯片比较

3.3.4检测限，线性关系和重现性

3.4 结论

3.5参考文献

第四章荧光量子点生物标记、纯化和表征

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1试剂和溶液

4.2.2仪器

4.2.3量子点的制备

4.2.4量子点生物连接

4.2.5量子点生物标记物的纯化

4.2.6电泳方法

4.3结果与讨论

4.3.1量子点及其生物大分子连接反应

4.3.2量子点生物标记物的纯化

4.3.3用毛细管电泳表征量子点生物标记物

4.4结论

4.5参考文献

第五章化学发光与纳米技术联用研究

5.1引言

5.2实验部分

5.2.1试剂和溶液

5.2.2仪器

5.2.3量子点的制备

5.2.4量子点生物标记

5.2.5量子点生物标记物纯化

5.2.6电泳过程

5.2.7荧光相关光谱实验方法

5.2.8免疫反应

5.2.9化学发光共振能量转移测定

5.3结果与讨论

5.3.1量子点的吸收光谱和发射光谱

5.3.2化学发光条件的优化

5.3.3量子点的化学发光共振能量转移现象

5.3.4化学发光共振能量转移在免疫体系中的应用

5.4结论

5.5参考文献

第六章全文总结

致谢

攻读博士学位期间已发表论文