中国玉米弯孢叶斑病菌致病性分化相关蛋白质组研究

摘要

玉米弯孢叶斑霉菌(Curvularia lunata(Wakker)Bocd)是引起玉米弯孢叶斑病的主要真菌病害，存在着严重的致病性分化。本实验利用蛋白质双向电泳、PDQuest2-D分析软件、MALDI-TOF MS质谱分析技术首次在蛋白质组水平系统研究了中国玉米弯孢菌的致病性分化相关蛋白表达差异及在寄主选择压力下致病性演化过程中蛋白质组消长规律；克隆了玉米弯孢菌致病性分化相关基因，研究了该基因在不同菌株不同生长阶段的组织表达差异；系统研究了玉米弯孢叶斑病菌致病相关因子黑色素的理化性质，明确了黑色素在玉米弯孢叶斑病菌致病性分化中的作用。主要内容包括： 构建了适用于玉米弯孢叶斑病菌菌丝全蛋白分离的2-DE优化技术体系。蛋白质裂解液以8M尿素，2M硫尿，100mM DTT，4％CHAPS，10mM PMSF，10％异丙醇，0.25％Tween-20，40mM Tris，0.25％两性电解质，5％甘油，0.002％溴酚蓝组成的裂解液制备样品效果较好；制备型蛋白质凝胶染色以0.25％G250的CBB染色方法最佳；12.5％聚丙烯酰胺凝胶分离效果最理想；等电聚焦以24000伏小时为最优。 比较了玉米弯孢叶斑病菌强病株系(CX-3，SD-60、C.152)和弱致病株(DD-60、WS-18、C107-1)蛋白质图谱的差异。可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳获得了110条蛋白质条带，其中68条(61.82％)为多态性条带，表明菌株间存在着较大的分化。聚类分析表明，几个菌株在阈值为0.605时分为三组，第一组包括具有较多的蛋白质条带的CX-3、SD-6、C-152以及WS-18，除WS-18外，接种鉴定为强致病类型，第二组和第三组包括C107-1和DD-60二个菌株，接种鉴定表现出弱致病性，表明病原菌可溶性蛋白的多态性与其致病性分化密切相关。 首次获得了玉米弯孢叶斑病菌不同致病类型间差异蛋白质组图谱。利用蛋白质分离的双向电泳技术分离出423个蛋白质，其中75个为差异蛋白质，包括28个蛋白质为强致病性菌特有蛋白质，8个蛋白质为弱致病菌特有蛋白质，39个蛋白质在两种致病类型中均有发现，但是蛋白质表达丰度不同；采用MALDI-TOF-MS方法鉴定出20个致病分化差异蛋白，包括病原真菌致病分化密切相关的Brnl，UBSR1和HSP等蛋白；参与病菌物质代谢、能量代谢、细胞信号转导蛋白及功能未知蛋白。在这些蛋白中，Brnl蛋白是参与病原菌黑色素合成且与致病性分化关系最为密切的蛋白之一。首次研究了玉米弯孢叶斑病菌在寄主选择压力下致病性演化的蛋白质组消长动态。采用弱致病菌株继代接种方法，分离并鉴定了继代接种后消失的蛋白3个，接种后诱导后出现的新蛋白4个，诱导后表达丰度增加的蛋白5个。这些蛋白中包括了参与信号识别及能量代谢、物质代谢的P115A糖蛋白、ACR056Wp、ADR311Cp及GTP-binding nuclear protein RAN/TC4，也包括了病原真菌致病分化密切相关的Brnl蛋白、scytalone脱氢酶等。 采用RACE技术克隆了玉米弯孢叶斑病菌致病性分化密切相关Brnl蛋白基因。根据质谱测定的氨基酸序列设计引物，克隆出BrnJ cDNA全长1001bp序列(GenBank accession No．DQ358052)，含801 bp的开放阅读框，编码267个氨基酸，推测蛋白质分子量为43 KD；序列的同源性分析结果表明，该基因是参与病原真菌中黑色素合成的一个重要基因。采用半定量PCR方法，比较了Brnl基因在玉米弯孢菌不同生长阶段的表达规律，结果表明Brnl基因在96 h的表达量明显大于24h，72 h的表达量，差异达极显著；在菌株生长的24 h、72 h和96 h，Brnl基因在玉米弯孢菌强致病菌株中的表达大于弱致病菌株，差异达极显著，说明该基因的表达与病原菌的致病性密切相关。 研究了玉米弯孢叶斑病菌黑色素的理化性质。采用酸碱沉淀浸提法提取了弯孢菌胞内及胞外黑色素，比较了二者的物理性质；采用紫外光谱法、红外拉曼光谱法及场电镜扫描法，确定了胞内黑色素为DHN型黑色素，胞外黑色素为DOPA；设计了黑色素接种和毒素接种比较实验，明确了玉米弯孢菌毒素是主要致病因子，黑色素联合接种可使病原菌的致病性加大。 探讨了玉米弯孢叶斑病菌黑色素的致病机理，初步研究了玉米弯孢菌Brnl基因表达与病原菌黑色素合成、病原菌致病性间的关系。黑色素接种实验表明，黑色素接种寄主后，寄主细胞质膜透性无明显变化，毒素接种后寄主细胞质膜透性增加，而黑色素与毒素联合接种后寄主细胞质膜透性增加幅度增大，说明毒素是病原菌致病的关键因子，黑色素影响致病性大小的关键因子；采用酶联免疫分析及免疫荧光电镜观察，确定了玉米弯孢菌黑色素存在于附着胞及侵染后扩展的菌丝中，无黑色素存在的菌株无致病性；采用实时荧光定量PCR技术和Northern blotting技术研究了黑色素合成受抑菌株及野生菌株在生长相同阶段的Brnl蛋白基因的表达差异，结果表明，在菌株黑色素合成受抑时，Brnl蛋白基因的表达弱，差异达极显著；进一步的接种实验证明，黑色素合成受抑，菌株的致病性明显下降，由此说明，玉米弯孢菌Brnl蛋白基因的表达与黑色素的生物合成、病菌的致病性间正向相关。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章文献综述

1、玉米弯孢叶斑病研究概况

2、玉米弯孢叶斑病菌致病性分化机理研究概况

2.1白化菌株的发现

2.2致病性类型的鉴定

2.3致病性分化的生理学基础

2.4植物病原真菌致病性分化的分子机制

2.5黑色素在弯孢病菌致病性中的作用

3、玉米抗主要病害蛋白质组学研究进展

3.1玉米弯孢霉叶斑病蛋白质组学

3.2玉米穗腐病蛋白质组学

3.3玉米腐霉菌苗病蛋白质组学

4、展望

4.1抗性遗传分析

4.2抗性基因筛选与功能分析

4.3病原菌生理分化机理

4.4全面认识植物病害发生与抗性机理

第二章玉米弯孢叶斑病菌蛋白质组双向电泳条件优化

1、材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.3水化上样缓冲液比较

1.4其它缓冲液的配制

1.5操作步骤

2、结果与分析

2.1最佳SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶浓度的确定

2.2蛋白质最佳提取方法的确定

2.3蛋白质裂解缓冲液的优化

2.4最佳等电聚焦条件的确定

3、小结

第三章 玉米弯孢叶斑病菌不同致病类型差异蛋白质组比较

1、材料与方法

1.1材料

1.2方法

2、结果与分析

2.1不同致病类型菌株侵染寄主的发病表现

2.2不同致病类型菌株单向电泳蛋白质图谱

2.3不同致病类型菌株双向电泳蛋白质图谱

2.4不同致病类型菌株差异蛋白质质谱测定

3、小结

3.1玉米弯孢叶斑病菌致病类型与可溶性蛋白多态性

3.2发现了致病类型分化相关蛋白标记

3.3病菌致病性分化的机制可能是多种蛋白质网络互作的结果

第四章寄主对弯孢菌弱致病类型蛋白质组变化的选择效应

1、材料与方法

1.1材料

1.2方法

2、结果与分析

2.1弱致病菌继代接种后致病性的变化

2.2弱致病菌继代接种后致病相关蛋白质组变化

2.3弱致病菌继代接种后致病分化相关蛋白质质谱鉴定

3、小结

第五章玉米弯孢叶斑病菌致病相关基因克隆与功能分析

1、材料与方法

1.1材料

1.2方法

2、结果与分析

2.1 Brn1蛋白基因的RACE克隆

2.2 Brn1在病菌中表达特性研究

3、小结

3.1 RACE技术获得全长cDNA基因

3.2 Brn1与病原菌的致病性

第六章玉米弯孢叶斑病菌黑色素性质及其功能分析

1、材料与方法

1.1材料

1.2方法

2、结果与分析

2.1黑色素的理化性质

2.2黑色素的紫外光谱分析

2.3黑色素的红外光谱表征

2.4黑色素的扫描电镜观察

2.5强、弱致病菌胞内黑色素产量比较

2.6黑色素致病功能分析

3、小结

3.1玉米弯孢叶斑病菌黑色素的理化性质

3.2玉米弯孢叶斑病菌黑色素的致病作用

讨 论

1、玉米弯孢叶斑病菌致病性分化相关蛋白质组学研究

2、玉米弯孢叶斑病菌黑色素合成相关Brn1基因表达分析

3、今后研究方向

结 论

参考文献

致 谢

博士后期间发表学术论文及申请课题目录

序列