Fabry病诊断体系及GLA基因突变型的临床与基础研究

摘要

Fabry病是一种少见的,以x连锁方式遗传的溶酶体贮积病 (lysosomal storagediseases,LSDs),男性新生儿的发病率约为1/40000.其发病机制是由于GLA基因突变导致α-半乳糖苷酶A(α-galA)的活性缺失或下降,致使鞘糖脂代谢出现异常,在机体血管内皮细胞及肾脏、心脏、皮肤、眼及神经系统等组织沉积,最终导致受累脏器的缺血性损害. 本研究首先对临床诊断的17例Fabry病先证者及59例家系成员进行了GLA基因检测,在17个家系中发现16种GLA基因突变,包括11种错义突变,2种无义突变,1个剪切突变,1个单碱基缺失和1个大片段缺失.这些突变散在GLA基因的2、3、4、5、6、7等外显子,16种突变中有十种突变(D165Y,L206P,F273L,A291T,A292P,W349R,R356G,IVS1-1G>A,1082DelG,44 bp nt.1077)为人类基因突变库中尚未见报道的新突变. 为了规范和完善Fabry病的诊断平台,本研究建立了外周血粒细胞α-galA活性的检测方法并分别检测13例男性半合子、8例女性杂合子和32例正常对照.男性半合子平均酶活性0.45±0.32nmol/hr/mg,所有男性半合子的α-galA酶活性值均远低于正常人水平,经典型患者低于正常值的1﹪,易于与正常人群区分,因此酶活性检测可以作为筛检 Fabry 病半合子的可靠手段.女性杂合子平均酶活性19.12±9.98nmol/hr/mg,其中两例杂合子患者酶活性结果处于临床正常值参考范围内,因此对于疑诊Fabry病的女性受检者或Fabry病家系女性成员,必须通过基因检测才能确诊.外周血粒细胞α-gal A活性检测具有操作简单、方便、诊断快速、低成本等优点. 本研究第三部分对16个家系的65例家系成员进行了外周血粒细胞α-gal活性和/或GLA基因突变筛查, 检出与先证者携带同样GLA基因突变的5例Fabry病半合子和22例杂合子.将本研究所确诊的21例半合子及25例杂合子的临床表型、基因型及酶活性结果进行分析后发现Fabry病的漏、误诊及延误诊断仍是普遍问题.半合子主要表现包括蛋白尿85﹪,肾功能不全50﹪,LVH355﹪,疼痛62﹪,血管角质瘤45﹪,少汗65﹪；杂合子主要表现包括疼痛16﹪,蛋白尿24﹪,LVNH60﹪.肾脏及心脑血管并发症是成年Fabry病患者面临的主要风险,Fabry病的多系统受累及其评估应引起重视.男性半合子的突变类型和酶活性水平及临床表型具有一定相关性,而女性杂合子的突变类型类型及酶活性与临床表型无明显相关. 研究在最后将野生型GIA基因的真核表达质粒定点突变,构建了3种突变型GLA基因真核表达质粒(A291T,R301Q,1082DelG),并分别瞬时转染COS-7细胞,48小时后测酶活性突变型组酶活性均显著低于野生型(p<0.01),A291T、1082DelG和R301Q在体外表达后的a-gal A酶活性依次为R301Q>A291T>1082DelG,与携带相应突变类型的半合子临床表型严重程度相符.体外实验证实了这些GIA突变型的致病性,并为判断不同突变类型导致酶活性不同程度的下降提供了依据.进一步使用20μM的脱氧半乳糖野生霉素(deoxygalactonojirimycin,DGJ)对转染的COS-7细胞进行干预后发现.A29lT和R301Q突变型转染组的酶活性均上升2倍以上(p<0.05),而1082DelG组酶活性上升不明显,提示A291T和.R301Q两种突变型对酶增强治疗可能有效,从而初步建立了小分子竞争性抑制剂治疗Fabry病的体外疗效预测体系,有望在今后应用于Fabry病患者治疗策略的选择.

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前言

第一部分中国人群Fabry病GLA基因突变研究

1引言

2材料与方法

2.1研究对象

2.2试剂

2.3主要仪器

2.4方法

3结果

3.1一般资料

3.2错义突变

3.3无义突变

3.4剪切突变

3.5缺失突变

4讨论

第二部分外周血粒细胞α-半乳糖苷酶A活性检测方法的建立及临床应用

1引言

2材料与方法

2.1研究对象

2.2试剂

2.3主要仪器

2.4方法

3结果

3.1正常人检测结果

3.2男性半合子检测

3.3女性杂合子检测

4讨论

第三部分Fabry病的家系调查及基因型及临床表型关联研究

1引言

2材料与方法

2.1研究对象

2.2方法

3结果

3.1家系调查结果

3.2先证者临床表型

3.3男性半合子临床表型-基因型分析

3.4女性杂合子临床表型-基因型分析

3.5典型家系介绍

4讨论

第四部分GLA基因突变型的体外功能及酶增强干预研究

1引言

2材料与方法

2.1研究对象

2.2试剂

2.3主要仪器

2.4方法

3结果

3.1真核表达质粒pCXN2-GFP，pCXN2-GLA鉴定

3.2定点突变的真核表达质粒pCXN2-GLA鉴定

3.3 COS-7细胞的瞬时转染

3.4瞬时转染后COS-7细胞的α-gal A酶活性检测

3.5 DGJ干预后COS-7细胞的α-gal A酶活性检测

4讨论

结论

参考文献

在读期间发表和撰写文章

在读期间学术会议投稿

致谢