产紫杉醇内生真菌的遗传转化及紫杉醇合成途径相关基因的克隆

摘要

紫杉醇是高效、低毒、广谱的天然抗癌药物，目前临床和科研所需的紫杉醇主要是从红豆杉中直接提取或是经化学半合成法合成。但是，天然红豆杉资源的稀缺、生长缓慢以及紫杉醇含量又极低制约了紫杉醇的市场供应。因此，采用各种手段积极寻求紫杉醇新药源生产途径，扩大紫杉醇供应能力，已成为紫杉醇产业发展的重点研究方向之一。以真菌取代红豆杉作为紫杉醇的药源，通过微生物发酵工程生产紫杉醇，也许是解决药源短缺的有效途径之一。 为解决紫杉醇药源短缺问题，本研究从两个方面开展研究：一是从我国珍稀药用植物红豆杉树皮中分离产紫杉醇的内生真菌，同时克隆内生真菌中紫杉醇合成途径相关基因并建立内生真菌的遗传转化系统，并将紫杉醇合成途径关键酶基因构建到真菌表达载体上，为利用基因工程手段提高内生真菌中紫杉醇含量、最终实现利用真菌发酵方法商业化生产紫杉醇打下基础。二是从产紫杉醇植物欧洲榛子中克隆紫杉醇合成途径相关基因，为今后利用基因工程手段将紫杉醇生物合成途径关键酶基因导入山榛中来提高紫杉醇含量提供候选基因。本研究得到如下结果： 1)利用表面消毒除菌方法从野生南方红豆杉树皮中分离到120个不同的内生真菌菌株，经三周摇床培养发酵、提取、浓缩后经HPLC、LC-MS对120个不同的内生真菌发酵液提取物进行检测，在编号为EFY-110的内生真菌发酵液提取物中检测到了紫杉醇及其重要前体巴卡亭Ⅲ。抗癌细胞活性实验结果表明，该菌株发酵液提取物能显著抑制或杀死肝癌细胞系BEL7402。根据生理特性和形态学特点，该菌株被鉴定为双孢束梗孢菌，将其命名为DF110，该菌株不同于国内外已报道的产紫杉醇内生真菌。 2)以本研究组以前分离到的产紫杉醇BT2菌株为研究材料，采用RACE技术，首次成功克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(BT2HMGR)的全长cDNA序列及其基因组序列，该基因全长3926 bp，含有一个3522 bp的开放阅读框，编码一个具有1173个氨基酸残基的蛋白，序列比对结果表明，BT2HMGR基因含有四个外显子和三个内含子；BLASTP分析显示，该基因编码的氨基酸与其它真菌的HMGR有较高相似性。Southem杂交表明，该基因在BT2基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR分析发现，BT2HMGR基因的表达受甲基茉莉酸(MeJA)诱导。 3)成功建立了利用限制酶介导整合(REMI)技术的产紫杉醇内生真菌BT2的遗传转化体系及检测方法，获得了42个稳定转化子，PCR和Southem blot分析证明外源潮霉素基因已被成功整合到BT2基因组中，转化频率大约是5-6个转化子/微克质粒DNA。该系统的建立为今后利用紫杉醇合成途径关键基因转化产紫杉醇内生真菌、提高其中的紫杉醇含量打下了基础。 4)首次将紫杉醇合成途径上的四个关键酶基因TS，DBAT，BAPT和DBTNBT分别构建到真菌表达载体pV2上，为转化产紫杉醇内生真菌提供了备选载体。 5)本研究采用RACE技术首次从产紫杉醇植物欧洲榛子Gasaway中克隆了紫杉醇合成途径重要基因HMGR(CgHMGR)全长cDNA序列。蛋白质序列多重比对发现，CgHMGR与其它植物的：HMGR具有很高同源性。Southern blot分析表明，CgHMGR属于一个多基因家族。RT-PCR分析发现，CgHMGR在榛子根、茎和叶中均表达，而在根中表达量最高。CgHMGR的表达受甲基茉莉酸诱导。功能测验实验表明，CgHMGR能加速大肠杆菌中胡萝卜素的积累，从而证明了CgHMGR编码一个功能蛋白。 6)本研究采用RACE技术首次从欧洲榛子Gasaway中分离到了IPI基因(CgIPI基因)全长cDNA序列。蛋白质序列多重比对结果表明，CgIPI蛋白和其它植物来源的IPI具有较高同源性。IPI系统发生树分析表明，CgIPI与其它植物来源的IPI具有共同的祖先。Southern blot分析表明，CgIPI基因属于一个多基因家族。组织特异性表达分析显示，CgIPI基因在榛子根中的表达量高于茎和叶中。功能测验实验表明，CgIPI基因能加速大肠杆菌中胡萝卜素的积累，从而证明了CgIPI编码一个功能蛋白。 7)本研究采用RACE技术首次克隆出了山榛的GGPPS基因(CgGGPPS基因)全长cDNA序列。蛋白质序列多重比对结果表明，CgGGPPS蛋白和其它植物来源的GGPPS蛋白具有较高同源性，CgGGPPS含有典型的异戊烯转移酶7个氨基酸保守区(Ⅰ-Ⅶ)。CgGGPPS系统发生树分析表明，CgGGPPS与H.brasiliensis中该蛋白有更近的亲缘关系。Southem blot分析表明，CgGGPPS基因属于一个多基因家族。RT-PCR分析表明，CgGGPPS基因在叶中的表达量高于根和茎中，CgGGPPS的表达受甲基茉莉酸诱导。 本研究论文报道了从我国珍稀药用植物南方红豆杉中分离到一株产紫杉醇及其重要前体巴卡亭Ⅲ的内生真菌DF110、克隆了产紫杉醇内生真菌BT2中的紫杉醇合成途径相关基因、建立了基于REMI技术的内生真菌遗传转化系统并分别构建了携带紫杉醇合成途径四个关键酶基因的真菌表达载体。同时，从产紫杉醇植物欧洲榛子Gasaway中克隆了紫杉醇合成途径三个重要基因(CgHMGR，CgIPI和CgGGPPS)，分析了这些基因在山榛基因组中的拷贝情况及组织表达特异性，以及HMGR和GPPS受甲基茉莉酸诱导的表达特征，并在大肠杆菌中验证了CgHMGR和CgIPI基因的功能。本研究为今后利用基因工程手段提高产紫杉醇内生真菌和山榛中紫杉醇的含量打下了基础，并对在在分子水平上深入了解产紫杉醇内生真菌和山榛中紫杉醇合成及其代谢调控机制具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

第一章文献综述

1.1引言

1.2紫杉醇简介

1.3红豆杉简介

1.4紫杉醇生物合成

1.4.1萜类前体IPP的生物合成

1.4.2紫杉醇骨架及侧链的生物合成

1.5紫杉醇的来源

1.5.1天然红豆杉植物提取

1.5.2化学合成

1.5.3植物组织细胞培养

1.5.4微生物发酵法

1.5.5从山榛等植物中提取紫杉醇

1.5.6基因工程

1.6产紫杉醇内生真菌研究进展

1.6.1植物内生真菌简介

1.6.2利用微生物发酵生产紫杉醇的优点

1.6.3发酵液中紫杉醇的检测

1.6.4产紫杉醇内生真菌的分离概述

1.6.5提高内生真菌产紫杉醇产量的途径

1.7丝状真菌的遗传转化的主要方法

1.8构建高产紫杉醇内生菌株的REMI技术

1.8.1 REMI转化的一般步骤

1.8.2 REMI转化的机制

1.8.3 REMI转化的主要优点

1.8.4 REMI转化存在的问题及前景展望

1.9本课题研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1.实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和载体

2.1.3试剂盒及购买的试剂

2.1.4自配溶液试剂

2.1.5仪器和设备

2.2实验方法

2.2.1内生真菌的分离

2.2.2发酵培养

2.2.3有机物质的萃取

2.2.4紫杉醇及紫杉烷类物质测定

2.2.5产紫杉醇菌株HMGR基因的克隆和特征分析

2.2.6生物信息学分析

2.2.7BT2HMGR基因组Southern blot分析

2.2.8基因表达的RT-PCR分析方法

2.2.9产紫杉醇内生真菌BT2原生质体的制备与再生率的测定

2.2.10原生质体的记数

2.2.1l限制酶介导(REMI)原生质体转化

2.2.12产紫杉醇内生真菌代谢工程前期准备工作

2.2.13山榛中紫杉醇合成途径上相关基因的克隆

第二章红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离及鉴定

3.1引言

3.2结果与分析

3.2.1产紫杉醇及其前体内生真菌形态特征及分类

3.2.2菌株DF110生产紫杉醇的检测结果

3.3讨论

第四章BT2菌株紫杉醇合成途径上HMGR基因的克隆和特征分析

4.1引言

4.2结果与分析

4.2.1 BT2菌株HMGR基因全长的克隆与特征分析

4.2.2 BT2HMGR蛋白的生物信息学分析

4.2.3 BT2HMGR基因的Southern blot分析

4.2.4 BT2HMGR基因的表达分析

4.3小结

第五章限制酶介导内生真菌遗传转化和分子鉴定

5.1引言

5.2结果与分析

5.2.1质粒DNA的检测

5.2.2原生质体的形态及制备的效率

5.2.3转化频率及转化子稳定性检测

5.2.4转化子的PCR检测

5.2.5转化子的Southern blot分析

5.3小结

第六章红豆杉TS,DBAT,BAPT和DBTNBT基因的克隆及真菌表达载体的构建

6.1前言

6.2红豆杉TS,DBAT,BAPT和DBTNBT基因的克隆

6.3中间载体pDC316-HPH的构建

6.4中间载体pDC316+TS,pDC316+BAPT,pDC316+DBAT和pDC316+DBTNBT的构建

6.5真菌表达载体pV2+TS,pV2+BAPT,pV2+DBAT和pV2+DBTNBT的构建

第七章欧洲榛子中紫杉醇合成途径上重要基因的克隆,特征分析及功能验证

7.1引言

7.2结果与分析

7.2.1山榛中总RNA和DNA的提取

7.2.2山榛3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(CgHMGR)

7.2.3山榛异戊烯基焦磷酸:二甲基丙烯基焦磷酸异构酶(CgIPI)

7.2.4山榛合成紫杉醇骨架的香叶基香叶基焦磷酸合成酶(CgGGPPS)

7.3本章小结

第八章结论与展望

8.1研究结论

8.2本研究的主要创新之处

8.3后续研究方向

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表、拟发表的论文