产紫杉烷类内生真菌的分离及紫杉醇合成相关基因的克隆

摘要

紫杉烷(taxane)类物质是一大类很重要的天然产物，多为一些植物或真菌的次生代谢产物。因其具有复杂的三环二萜结构，很多紫杉烷类物质具有一些独特的生理药效功能，其中，紫杉醇(Taxol)因为能有效地治疗晚期卵巢癌、乳腺癌等多种癌症，目前已成为世界上首选的、最畅销的抗癌药物之一，并且市场出现供不应求的局面。现在，临床和科研上所需的紫杉醇多是从红豆杉植物中提取，或是由从红豆杉中提取的紫杉醇前体巴卡亭Ⅲ(baccatin m)经化学半合成法人工合成。但是，天然植物中紫杉醇含量太低且红豆杉资源有限，制约了紫杉醇的商业化生产。因此，有必要寻找新的资源和途径来提高紫杉醇的产量，以改善紫杉醇长期供应不足的局面，缓解临床、科研上对紫杉醇迫切需要的压力，同时满足广大患者的需求。 本研究从两个方面着手，一是通过表面消毒除菌的方法从野生的南方红豆杉中分离产紫杉烷类的内生真菌，并对该类内生真菌做初步的分子遗传学和遗传转化分析，旨在为以后通过微生物发酵培养来生产紫杉醇打下基础和提供备选菌种；二是在本实验室原有的研究基础上，对目前商业上广泛种植的栽培种—曼地亚红豆杉中紫杉醇合成途径上的重要的关键酶基因DBAT进行克隆、特征分析和功能验证，为以后通过基因工程手段对曼地亚红豆杉进行遗传改良来提高红豆杉中紫杉醇及其前体巴卡亭III的含量打下坚实的基础和提供候选基因。 主要研究结果如下： 1)通过表面消毒除菌的方法从野生的南方红豆杉中分离到21个不同的内生真菌菌株；根据分离菌的生理特性和形态学特点，包括培养基、分泌色素、菌落的生长速度、菌丝体以及孢子的特征等，对其中的8个菌株进行了分类鉴定，其余菌株由于形态特征不够明显尚未做鉴定。 2)经HPLC、LC-MS对21个内生真菌菌株发酵液提取物进行检测，结果表明：在编号为XT2的内生真菌发酵液提取物中同时检测到紫杉烷类物质Baccatin III和Taxol的存在，所以将其命名为BT2；MTT(四甲基偶氮唑蓝)实验结果进一步表明，BT2菌株发酵液提取物同紫杉醇标准品一样，都能有效抑制或杀死肝癌细胞系7402和肺癌细胞系A549肿瘤细胞。根据其生理特性和形态学特征，BT2菌株为一丝状内生真菌，归属于束丝菌属(Ozonium sp．)，不同于以前任何报道的产紫杉烷类物质的内生真菌。 3)以BT2菌株基因组DNA和cDNA为模板，同源克隆到了一个细胞色素P450家系的紫杉烷类10β-羟化酶基因(GenBankAccession No．AY836677)及其cDNA序列(GenBank Accession No．AY907826、)。在Genbank中的Blastn序列比对显示该基因与多种红豆杉属中报道克隆的10 β一羟化酶基因有很高的同源性(>90％)。通过Southern杂交分析了该基因在真菌基因组中的拷贝情况，结果表明该基因属于一个多基因家族，符合细胞色素P450家系基因特征。通过N0rthem杂交初步分析了该基因受外界诱导子茉莉酸甲酯的诱导表达情况，其表达特征与红豆杉中报道的其他基因类似，证明该基因能够被茉莉酸甲酯诱导表达。这是迄今为止关于产紫杉烷类物质内生真菌中有关紫杉醇合成相关基因的首次报道。 4)对BT2菌株进行了抗生素(潮霉素)敏感实验，发现潮霉素对BT2菌株的临界致死浓度为100μg/ml，该浓度可作为对BT2菌株进行遗传转化的潮霉素筛选浓度。通过正交组合实验，确定了分离BT2真菌原生质体的最佳酶解系统为1.5％(w/v)溶壁酶+0.5％(w/v)蜗牛酶+1.5％(w/v)纤维素酶+1.0％(w/v)溶菌酶；用此酶系统在28℃条件下酶解3 h，原生质体的产量达2.41×10<’6>个/ml酶液；而酶解温度提高到30℃时，原生质体的产量可达6.55×10<’7>个/ml酶液。通过荧光素二乙酸酯(FDA)染色法测定了BT2真菌原生质体的活性，证实制备的BT2真菌原生质具有高效活性，可以用来做后续转化的实验材料；分别利用CaCl<,2>-PEG介导的原生质体转化和根癌农杆菌介导(ATMT)的菌丝体转化两种方法对BT2菌株进行遗传转化，对转化条件进行了探索，为建立BT2菌株的遗传转化系统和获得转基因菌株打下了基础。 5)以商业用栽培种曼地亚红豆杉为材料，通过RACE技术成功克隆了曼地亚红豆杉中编码10-去乙酰巴卡亭III乙酰基转移酶的全长cDNA(TmDBAT)；S0uthern杂交分析表明该基因属于一小的多基因家族，符合酰基转移酶家系特征；通过RT-PCR全面分析了该基因受不同诱导子[硝酸银(silver nitrate，SN)、硫酸铈铵(ammonium cericsulphate，ACS)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MJ)]诱导下的表达特征，发现这些诱导子均能不同程度地诱导该基因的表达。将该基因的完整编码阅读框构建到表达载体后在Escherichia coli中成功地实现了该基因的表达，产生出具有生物活性的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰基转移酶，该酶在体外能够催化底物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和乙酰辅酶A生成目标产物巴卡亭Ⅲ，从而验证了所克隆基因的功能。 本论文系统报道了我国珍稀的药用植物资源南方红豆杉中一株产紫杉烷类物质Baccatin Ⅲ和Taxol的内生真菌BT2(Ozonium sp．)的分离、分类、发酵培养及产物鉴定的全过程，并对该内生真菌做了进一步的分子生物学特征分析和原生质体制备、遗传转化的初步实验，得到许多前人未报道过的实验结果，因此，本研究结果具有重要的创新性并且对其它植物／内生真菌及其代谢物的研究具有积极的借鉴意义。同时，本文还对商业用栽培种曼地亚红豆杉中紫杉醇合成途径中一个重要的关键酶基因DBAT成功进行了克隆，并全面分析了该基因在植物基因组中的拷贝情况及受不同的诱导子诱导处理下的表达特征，进而通过原核表达得到了该基因编码的蛋白并在体外验证了该蛋白的活性；该研究对深入了解曼地亚红豆杉中紫杉醇合成及其代谢调控机制具有重要意义，也为今后利用基因工程手段对曼地亚红豆杉进行遗传改良来提高红豆杉中紫杉醇及其前体巴卡亭Ⅲ的含量打下基础并提供了一个重要的候选基因。

目录

文摘

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第一章文献综述

第二章材料与方法

第三章红豆杉中内生真菌的分离及紫杉烷类物质的鉴定

第四章BT2菌株中紫杉醇合成途径相关基因的分离、分析

第五章BT2菌株的遗传转化研究

第六章曼地亚红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰基转移酶基因的克隆与功能验证

第七章总结与展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表、拟发表的论文

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