肺癌血清蛋白指纹图谱的构建及临床应用

摘要

目的：肺癌的早期诊断与治疗方案的选择和预后密切相关，为了提高肺癌目前的低检出率，我们采用表面增强激光解析及电离飞行时间质谱技术建立肺癌的血清蛋白指纹图谱和质谱模型来区分肺癌及非肺癌病人(包括正常人和/或肺良性疾病病人)，探讨该模型在肺癌诊断中的应用价值。在此基础上，我们分别观察了肺癌病人三维适形放疗和泰素帝化疗前后血清蛋白质组的改变，寻找与放疗、化疗相关的诱导蛋白，并探讨它们与治疗疗效之间的关系，寻找与肺癌放、化疗预后相关的生物标志物。 方法：采用SELDI-TOF-MS技术分别对151例初诊肺癌(男89例，女62例，年龄在29～75岁，平均年龄为57.8岁；鳞状细胞癌62例，腺癌65例，SCLC24例；UICC1997：Ⅰ/Ⅱ期35例，Ⅲ/Ⅳ期116例)、96例肺良性疾病(男62例，女40例，年龄在30～74岁，平均年龄为57.6岁；急性肺炎27例，慢性支气管炎18例，支气管哮喘和炎性假瘤各9例，肺纤维化12例，慢性阻塞性肺气肿21例，排除其它疾病证据)和102例正常人(男62例，女40例，年龄在30～74岁，平均年龄为55.6岁)的血清进行蛋白质谱检测。另外我们用ECLIA法检测了肺癌血清中的CEA和Cyrfa-21-1水平。所得的蛋白质质谱作以下各组比较：(1)肺癌组与正常人之间比较：训练组和测试组的肺癌和正常人分别在性别、年龄和吸烟史等方面无统计学差异。89例肺癌和68例正常人作为训练组，进行训练与交叉验证，将筛选出来的5808Da、5971Da和7779Da的3个质荷比峰作为输入，建立分类决策树预测模型。随机选择另外62例肺癌和34例正常人作为测试组对该模型的有效性进行盲法验证。(2)肺癌组与非肺癌组之间比较：训练组和试验组的肺癌和非肺癌病人在性别、年龄和吸烟史等方面无统计学差异。89例肺癌和132例非肺癌病人作为训练组，进行训练与交叉验证，将筛选出来的分子量为4325Da、4485Da、5252Da、5969Da、9137Da、9183Da、11731Da、13878Da、15341Da和15867Da的`10个蛋白波峰建立分类决策树预测模型。随机选择另外62例肺癌和66例非肺癌病人(包括34例正常人和32例肺良性疾病)作为试验组对该模型进行盲法验证。(3)64例局部进展期的病人行三维适形放射治疗，放疗总剂量为60GY。均取放疗结束后第2d血清行蛋白质谱检测，并与放疗前作自身对比，寻找与放疗相关的差异蛋白并探讨它们与放疗疗效之间的关系。(4)151例肺癌中有31例完成了至少2周期的泰素帝单药化疗。泰素帝用法：35mg/m2d1、8、15，加500ml生理盐水静脉滴注30～60分钟，28d为1个周期，化疗前给予预处理。取第1个周期第1次用泰素帝化疗后第3d的血清行蛋白质谱检测分析，寻找与泰素帝化疗相关的差异蛋白或诱导蛋白。 结果： (1)肺癌与正常人之间比较：训练组平均每张质谱图包包含48个聚类或常见波峰。两组相比有差异的蛋白质峰为34个，其中20个平均波峰强度存在显著性差异。BPS将分子量为5808Da、5971Da和7779Da的3个蛋白建立的分类决策树预测模型对训练组总体准确率为94％；将包含62例肺癌和34例正常人作为测试组对该分类决策树的有效性进行盲法验证，结果总体准确率为90％，敏感性为89％(55/62)，特异性为91％(31/34)；与肺癌常用的标志物CEA或Cyfra21-1相比，除CEA的特异性与SELDI无明显差异外(p＞0.05)，Cyfra21-1的特异性和两者的敏感性均明显低于SELDI，表明SELDI在鉴别肺癌和正常人的敏感性和特异性较常用的标记物有明显优势。同时分子量为5808Da和5971Da的蛋白在肺癌病人血清中波峰强度明显升高，约为正常人的6倍。 (2)肺癌组与非肺癌组之间比较：训练组平均每张质谱图谱包含57个聚类波峰或常见波峰。肺癌组和非肺癌组相比有差异的蛋白质峰为`39个，其中24个蛋白平均波峰强度差异显著(p＜10-4)。BPS将分子量为4325Da、4485Da、5252Da、5969Da、9137Da、9183Da、11731Da、13878Da、15341Da和15867Da的10个蛋白建立的分类决策树预测模型对训练组总准确率为90.0％(199/221)；将包含62例肺癌和66例非肺癌病人作为测试组对其有效性进行盲法验证，总准确率为82.8％(106/128)，敏感性为79.0％(49/62)，特异性为86.4％(57/66)。亚组分析：该分类决策树能正确区分84.0％(42/50)的NSCLC和58.3％(7/12)的SCLC病人(P＜0.05)以及71.4％(10/14)的Ⅰ/Ⅱ期和81.3％(39/48)的Ⅲ/Ⅳ期肺癌病人(P＞0.05)。与CEA或Cyfra21-1比较，两者的敏感性和特异性均明显低于SELDI(p＜0.05orp＜0.005)。其中分子量为5252Da和5969Da的蛋白平均波峰强度在肺癌病人较非肺癌病人显著升高。 (3)局部进展期肺癌病人放疗前后血清差异蛋白比较：64例肺癌放疗前后共获得128张质谱图，平均每张质谱图谱包含69个聚类波峰或常见波峰。分析结果显示：差异的蛋白质峰为10个(P＜0.05)，分子量分别为5928Da，6115Da，9295Da，5972Da，9201Da，6637Da，11729Da，15136Da，15342Da和7787Da，其中分子量为5928Da的蛋白质放疗后波峰强度明显降低(P＜10-4)。BPS经过交叉变量分析，优化出仅由1个分子量为5928Da蛋白质组成的鉴别肺癌放射治疗前后的分类决策树。该分类决策树对放疗前后病人准确率分别为100％(64/64)和81.3％(52/64)；亚组分析：局控和局部未控病人的准确率分别为80.8％(42/52)和83.3％(10/12)。该蛋白在局控病人放疗后较放疗前明显降低(10.19168±5.49914vs2.97852±1.83534，P＜0.005)，但在局部未控病人放疗前后未见明显改变(9.01076±3.79699vs8.34565±4.99100，P＞0.05)；同样对于放疗后局控和局部未控的病人，该蛋白波峰强度明显降低(2.97852±1.83534vs8.34565±4.99101，P＜0.05)，而两组在放疗前无统计学差异(10.19168±5.49914vs9.01076±3.79699，P＞0.05)。研究结果表明，肺癌病人放射治疗前后血清蛋白的差异明显，检测特异性的差异蛋白有助于监视肺癌的放疗过程及预测放疗的疗效。分子量为5928Da的蛋白质可能系与放射治疗相关的血清蛋白，有可能成为与肺癌放射治疗预后相关的生物标记物。我们检索了ExPASy生物信息库，在已知蛋白多肽中对分子量为5928Da的多肽进行匹配，发现该蛋白或多肽可能系纤维蛋白E轻链(FibrinogenAlphaEChain)的一个片断。 (4)泰素帝化疗前后血清差异蛋白的比较：31例肺癌化疗前后共获得62张质谱图，平均每张质谱图谱包含53个聚类波峰或常见波峰。质谱图谱分析结果显示，有显著差异的蛋白质峰为14个(P＜0.05)，分子量分别为4471Da，6116Da，6134Da，7568Da，7939Da，8152Da，9300Da，11089Da，11725Da，11817Da，14046Da，14974Da，15131Da和15336Da。其中分子量为4471Da的蛋白质化疗后其平均波峰强度明显升高，约为化疗前的2倍(1.369487154vs0.625581851，P＜0.001)；而其余13个蛋白平均波峰强度化疗后显著降低。BPS经过交叉变量分析，优化出一个由分子量为2956Da、4471Da、5342Da、5910:Da、6134Da、6939Da、7568Da、7939Da、9193Da、9300Da和11817Da的11个蛋白质组成的能有效鉴别化疗前后的肺癌病人分类决策树预测模型。该分类决策树预测模型对化疗前后总体准确率分别为100.0％(31/31)和83.9％(26/31)；亚组分析结果显示，对有效、稳定和进展的病人的准确率分别为100.0％(9/9)、70.0％(7/10)和83.3％(10/12)。化疗后病人31例中有23例该蛋白波峰明显，占74.2％(其中PR9例、SD7例、PD7例)，而化疗前仅有6例表现为强度较弱的波峰，同时该波峰在正常人中尚未被观察到。以上研究结果表明，分子量为4471Da的蛋白可能是泰素帝诱导蛋白或多肽片断，也可能系机体对化疗药物产生的反应性蛋白。用SELDI-TOF-MS技术不仅可以有效地监测化疗过程，而且有可能预测化疗的疗效以及肺癌对化疗药物的敏感性。 结论： 1、肺癌与正常人、肺良性疾病及肺癌放、化疗前后血清蛋白质组学水平差异显著。 2、分子量为5808Da、5252Da、5971Da或5969Da的蛋白质可能成为肺癌诊断新的标志物。 3、应用多波峰组成的质谱诊断模型对肺癌诊断的价值优于单一标志物。 4、分子量为5928Da的蛋白可能成为预测放射治疗预后新的标志物。 5、分子量为4471Da的血清蛋白可能系泰素帝诱导的相关蛋白，可能成为预测化疗疗效的标志物。 6、利用蛋白质组学技术结合生物信息学分析将有利于建立肺癌诊断模式--指纹图谱。 7、SELDI-TOF-MS技术是寻找肺癌及其治疗性相关蛋白的有效工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略语对照表

前言

第一部分血清蛋白指纹图谱技术用于肺癌与正常人的鉴别诊断

1.材料和方法

2.结 果

讨 论

结论

参考文献

附图

第二部分血清蛋白指纹图谱技术用于肺癌与非肺癌病人鉴别诊断

1.材料和方法

2.结 果

讨 论

结论

参考文献

附图

第三部分血清蛋白指纹图谱技术寻找与肺癌放射治疗预后相关的生物标记物

1.材料和方法

2.方法

3.结 果

讨 论

结论

参考文献

附图

第四部分血清蛋白指纹图谱技术寻找与肺癌化学治疗预后相关的生物标记物

1.材料和方法

2.结 果

讨 论

结论

参考文献

附图

研究小结

文献综述 肺癌血清蛋白质组学中研究进展

在站期间撰写论文

致 谢