小分子化合物添加促进灵芝酸的发酵生产及其作用机制探索

摘要

灵芝酸具有抗肿瘤等重要药理活性,但其低生产率是制约其广泛研发及应用的瓶颈。本实验室先前报道的两阶段液体静置培养方法可大幅度提高灵芝酸的发酵产量,但仍难满足其应用需求。本学位论文探讨了灵芝菌丝体两阶段发酵过程中,通过添加小分子化合物即苯巴比妥和咪康唑,使灵芝酸的发酵产量获得进一步的提高,并探讨了添加剂对该次级代谢产物生物合成的作用机制。实验结果表明,苯巴比妥的最佳添加量为100μM(终浓度),最佳添加时间为静置培养第5天;灵芝酸的总含量达41.4±0.6mg/gDW,其中单体灵芝酸Mk,-T,-S和-Me的最大含量比对照(添加DMSO)分别提高了30-60％;同时,代谢途径中的三个重要基因,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(hmgr),鲨烯合成酶(sqs)和羊毛甾醇合成酶(ls)的转录水平均有提高,而重要中间体羊毛甾醇的含量比对照条件有明显下降,这表明苯巴比妥促进了灵芝酸的生物合成代谢途径,羊毛甾醇被更快地转化成了产物灵芝酸。咪康唑的最佳添加条件为第7天添加10μM(终浓度)。添加咪康唑后,总灵芝酸的含量达30.4±0.4mg/gDW,其中四种单体灵芝酸的含量分别比对照(添加DMSO)增加了20-35%;同时,细胞中麦角固醇的含量下降了约50%,而羊毛甾醇含量出现增加,这提示,咪康唑的添加抑制了细胞内羊毛甾醇转化成麦角固醇,从而促进了羊毛甾醇向灵芝酸的转化。此外,我们也检测了代谢途径中四个重要基因(hmgr,sqs,ls,以及14α-脱甲基酶(14α-ldm))的转录水平。这些结果表明,添加咪康唑后,这几个基因的转录水平均有所下降,故咪康唑对灵芝酸生物合成的作用机制需要今后进一步研究。本论文报道了一种有效提高灵芝酸含量的方法,并对其作用机制做了初步探讨。所获得的有关信息对于灵芝酸及其它三萜类次级代谢产物的高效生产和调控具有一定的参考价值。

目录

摘要

ABSTRACT

目录

第一章 绪论

1.1 高等真菌

1.2 灵芝及其活性成分

1.2.1 灵芝

1.2.2 灵芝的活性成分

1.2.3 灵芝酸及其药理活性

1.3 灵芝酸的代谢途径研究进展

1.4 灵芝酸发酵生产研究进展

1.5 立题的目的与意义

1.6 本论文的主要研究内容

第二章 苯巴比妥添加提高静置发酵灵芝菌丝体中灵芝酸的含量

2.1 前言

2.2 实验材料与方法

2.2.1 菌种

2.2.2 试剂

2.2.3 菌丝体培养

2.2.4 实验方法

2.3 结果

2.3.1 苯巴比妥添加时间对细胞生长和灵芝酸产量的影响

2.3.2 苯巴比妥添加量对细胞生长和灵芝酸产量的影响

2.3.3 最佳添加条件下，细胞生长、糖消耗及灵芝酸的积累

2.3.4 最佳添加条件下羊毛甾醇含量的变化

2.3.5 苯巴比妥添加对灵芝酸代谢途径中重要基因表达的影响

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 咪康唑添加提高静置发酵灵芝菌丝体中灵芝酸的含量

3.1 前言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 试剂

3.2.3 菌丝体培养

3.2.4 实验方法

3.3 结果

3.3.1 咪康唑添加时间对细胞生长和灵芝酸产量的影响

3.3.2 咪康唑添加量对细胞生长和灵芝酸产量的影响

3.3.3 最佳添加条件下细胞生长、糖消耗及灵芝酸的积累

3.3.4 最佳添加条件下羊毛甾醇和麦角固醇含量的变化

3.3.5 咪康唑对灵芝酸代谢途径中重要基因表达的影响

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 结论与展望

4.1 全文结论

4.2 本文的特色与创新点

4.3 展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文和申请的专利

致谢