农用抗生素120的生物合成和细菌中DNA磷硫酰化基因功能的研究

摘要

农用抗生素120(简称“农抗120”)是由刺孢吸水链霉菌北京变种产生的一种具有广谱抗真菌活性的农用抗生素。它不仅对白粉病、炭疽病等多种真菌病原菌具有显著的防治功效,同时具有促进植物增产的作用,因而在植物真菌病害生物防治、促进农业生产方面发挥了重要的作用。农抗120由刺孢吸水链霉菌北京变种的多种次级代谢产物组成,然而其活性成分至今尚未明确。因此,本研究通过对刺孢吸水链霉菌北京变种中的次级代谢产物进行分离鉴定,明确了农抗120中的两种脂溶性活性成分,并试图阐明这两种活性成分的生物合成途径,进而能够在分子水平上进行相应的定向改造,提高其活性和产量,最终提高农抗120的生物防治功效及社会经济效益。
　　 本研究通过对刺孢吸水链霉菌北京变种的次级代谢产物进行分离、纯化,利用高压液相色谱.质联用技术对其进行检测显示,一种组分是茴香霉素及其衍生物,另一种组分是四烯类化合物。两者都对农抗120生物活性指示菌具有明显的抑菌作用。通过核磁共振对分离纯化的四烯化合物进行结构鉴定证明该成分为四霉素B组分(Tetramycin B)。此外也在发酵产物中检测到了四霉素的A组分。
　　 基于基因组扫描序列,对四霉素B组分的生物合成途径进行分析,发现了与四霉素B组分生物合成相关的基因簇。基因中断实验证明突变株YF21不产四霉素A、B两组分,由此证明该基因簇与四霉素合成相关。通过分析发现该基因簇包含四霉素合成所需要的Ⅰ型聚酮合酶和其他后修饰基因等,并对其生物合成途径进行了推测。四霉素生物合成基因簇的获得为后续的组合生物合成、农抗120生物活性提高等尝试提供了研究基础。对于另一组分茴香霉素,尝试了利用O-甲基转移酶基因的兼并引物的PCR扩增、异源表达以及基因组扫描序列信息分析等多种不同的方法挖掘其生物合成基因簇,为进一步克隆茴香霉素生物合成基因建立了基础。
　　 DNA大分子研究是生命科学研究的热点领域,在天然DNA骨架上发现的硫修饰构成了对DNA结构的又一新补充。因此,进一步研究DNA分子骨架硫修饰的生物化学基础,探索DNA分子硫修饰在基因表达和DNA修复、限制和修饰方面的作用,揭示DNA磷硫酰化修饰的生物学功能具有重要意义。本研究主要以细菌荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescence Pf0-1和沙门氏菌Salmonella enterica serovar Cerro87为材料开展了以上两方面的研究。
　　 源于变铅青链霉菌的DNA磷硫酰化修饰现象广泛存在于细菌中,在荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescence Pr0-1中也含有与dnd同源的基因簇。本工作证明了在荧光假单胞菌中证明SpfD蛋白参与该菌株的Dnd表型,并且体外实验证实该蛋白具有ATPase酶活性。由此推测DndD同源蛋白有可能在DNA骨架上磷硫酰化修饰参与能量供给的作用,从而初步解析了SpfD蛋白在DNA分子骨架硫修饰生物化学途径中的作用,为进一步体外重建DNA磷硫酰化修饰的生化过程提供了相应的参考。
　　 在沙门氏菌Salmonella enterica Cerro87中,dpt基因簇赋予宿主Dnd表型和磷硫酰化依赖的限制修饰作用。本研究在此基础上观察到缺失DNA磷硫酰化修饰基因dptBCDE的突变株XTG102在生理形态表型上与野生型有明显的差异。研究发现缺失整个DNA磷硫酰化修饰基因的突变株不仅生长滞缓,而且在菌落和细胞形态方面变化明显。通过对dpt的单基因同框缺失表明,dptC和dptE的突变株YF11和YF13对生长有滞缓作用,但菌落和细胞形态方面差异不明显。由此推测,dpt基因簇中负责磷硫酰化修饰的dptBCDE四个基因和负责潜在限制功能的dptFGH三个基因分别形成复合体,它们相互作用从而实行宿主的限制修饰功能并保持菌体的正常生长。该现象的发现对后续研究DNA磷硫酰化修饰所具有的生物学意义具有重要参考价值。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 文献综述

第1节 链霉菌简介

第2节 抗生素的作用机制

第3节 多烯类抗生素的研究进展

1.3.1 匹马霉素

1.3.2 裂霉素

第4节 链霉菌中DNA降解现象的发现

第5节 链霉菌及细菌中DNA异常修饰的研究进展

1.5.1 变铅青链霉菌中异常修饰基因簇的分离、鉴定

1.5.2 异常修饰的本贡--DNA硫修饰

1.5.3 DNA硫修饰的化学本质

1.5.4 DNA硫修饰的其他研究进展

1.5.5 DNA磷硫酰化修饰的生物学意义初探

第6节 本研究背景、内容和目的

1.6.1 本研究背景

1.6.2 本研究的内容和目的

1.6.3 本研究的目的

第二章 实验材料和方法

第1节 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 引物

2.1.4 培养基和试剂

第2节 实验方法

第三章 刺孢吸水链霉菌北京变种次级代谢产活性成分鉴定

第1节 农抗120活性组分-茴香霉素的分离和鉴定

第2节 四霉素B的分离纯化和结构鉴定

第四章 农抗120中活性成分生物合成基因簇的挖掘

第1节 刺孢吸水链霉菌北京变种的基因文库构建

第2节 刺孢吸水链霉菌北京变种的基因组扫描

第3节 四霉素生物合成基因簇的定位

第4节 四霉素生物合成基因簇完整序列拼接

第5节 四霉素生物合成基因簇功能分析

第6节 四霉素生物合成基因簇与四霉素B组分的相关性验证

第7节 四霉素与匹马霉素生物合成基因簇的比较

第五章 茴香霉素生物合成途径的探索

第1节 氧甲基转移酶为探针克隆茴香霉素生物合成基因的研究

第2节 异源表达克隆茴香霉素生物合成基因的研究

第3节 基因组扫描克隆茴香霉素生物合成基因的研究

第六章 沙门氏菌中DNA磷硫酰化修饰生理表型研究

第1节 沙门氏菌突变株XTG102的异常生理表型观测

6.1.1 突变株XTG102菌落形态表型

6.1.2 突变株XTG102液体生长表型

6.1.3 突变株XTG102细胞形态表型

第2节 沙门氏菌中dpt单基因同框缺失突变株的构建

6.2.1 dptB同框缺失突变株YF10的构建

6.2.2 dptC同框缺失突变株YF11的构建

6.2.3 dptD同框缺失突变株YF12的构建

6.2.4 dptE同框缺失突变株YF13的构建

6.2.5 dptH同框缺失突变株YF14的构建

6.2.6 ORF5同框缺失突变株YF15的构建

第3节 dpt单基因同框缺失突变株的表型检测

6.3.1 突变株Dnd表型检测

6.3.2 突变株菌落形态表型检测

6.3.3 突变株生长趋势表型检测

6.3.4 突变株细胞形态表型检测

第七章 荧光假单胞菌Pf0-1中与DNA磷硫酰化相关基因spfD的功能研究

第1节 荧光假单胞菌Pf0-1中Dnd现象与spfD基因的相关性

7.1.1 荧光假单胞菌中spf基因簇与dnd基因簇的比对

7.1.2 spp基因与荧光假单胞菌中Dnd表型的相关性

第2节 spfD基因的表达和纯化

第3节 spfD基因的功能探索

第八章 本研究工作总结和展望

第1节 本研究工作总结

第2节 本研究主要创新点

第3节 工作展望

参考文献

攻读学位期间发表学术论文和所获奖励

致谢