小干扰RNA靶向抑制雄激素受体基因对膀胱癌生长的影响研究

摘要

目的:观察RNA干扰雄激素受体(androgen receptor,AR)基因对体外培养的人膀胱癌细胞增殖、凋亡的作用以及对裸鼠膀胱癌移植瘤的抑瘤效应,探讨AR信号通路在膀胱癌发生、发展中的作用。
　　 方法：(1)应用免疫组化和qRT-PCR检测膀胱癌细胞株中AR的表达,用MTT法分析检测双氢睾酮(DHT)对膀胱癌细胞的增殖、抑制作用。(2)合成靶向人AR基因的siRNA,使用脂质体转染的方法导入膀胱癌细胞T24、253J中,采用qRT-PCR、Western blot检测转染前后细胞AR mRNA和蛋白的表达；转染细胞后用MTT法检测细胞体外的增殖活性,流式细胞术检测细胞的凋亡状况,用荧光定量法检测Caspase-3的活性,用Transwell小室检测细胞的迁移能力,用qRT-PCR检测抑制AR表达后对相关生长调控基因的调节。(3)建立膀胱癌细胞T24裸鼠皮下移植瘤模型,采用电穿孔方法转染AR siRNA；用qRT-PCR检测移植瘤中AR表达水平；计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线；用免疫组化法检测瘤体组织Ki67的表达；TUNEL法检测移植瘤组织的细胞凋亡水平。
　　 结果：(1)膀胱癌细胞株T24、253J中AR呈阳性表达,膀胱癌细胞株5637中AR不表达；不同浓度的DHT(0、10nM、100nM、1μM、10μM)刺激T24细胞,低浓度的DHT(10nM)可明显促进细胞的增殖,而高浓度的DHT(10μM)使细胞的增殖受到抑制；10nM DHT也可促进AR阳性表达的253J细胞的增殖,但对AR阴性表达的5637细胞增殖无影响。(2)脂质体法转染膀胱癌细胞后,qRT-PCR和Western blot检测结果显示ARsiRNA使膀胱癌细胞中AR mRNA和蛋白表达下调；膀胱癌细胞AR基因被沉默后,MTT分析显示细胞的增殖活性被抑制；流式细胞术检测结果表明细胞早期凋亡率明显增加；用荧光定量法检测细胞内的Caspase-3的活性增高；Transwell小室证实细胞迁移能力下降；抑制膀胱癌细胞的AR表达能下调Cyclin D1、Bcl-xL、MMP-9基因的表达,而上调TGF-β基因的表达。(3)电穿孔介导的靶向AR基因的siRNA能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长,Ki67免疫组化显示瘤体细胞增殖指数降低,TUNEL法检测细胞凋亡指数升高。
　　 结论：AR介导的雄激素或非雄激素信号通路对膀胱癌细胞的生长有一定的促进作用。siRNA介导的RNAi能有效抑制AR基因的表达,并能抑制膀胱癌细胞的增殖,促进了细胞的凋亡,降低了细胞的迁移能力,抑制裸鼠体内膀胱癌移植瘤的生长。靶向AR的RNAi有望为膀胱癌的临床治疗研究提供新的思路和方法。

目录

文摘

英文文摘

上海交通大学学位论文答辩决议书

符号说明

前言

第一部分 膀胱癌细胞株中AR的表达及雄激素对膀胱癌细胞生长影响的研究

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

第二部分 小干扰RNA抑制AR基因表达对膀胱癌细胞生长影响的研究

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

第三部分 电穿孔法介导AR基因沉默对裸鼠膀胱癌移植瘤生长抑制的研究

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

参考文献

附录

参考文献

致谢

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