卵巢癌微环境中成纤维细胞对卵巢癌转移的作用探讨

摘要

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,死亡率高居妇科肿瘤之首,是目前已知肿瘤中死亡率最高的肿瘤之一。卵巢癌患者的早期诊断困难,超过70％的卵巢癌患者确诊时已经属于晚期,并发生了多处转移,临床预后很差。因此,进一步明确卵巢癌的发生、发展和转移等过程,对卵巢癌的诊断和确立治疗靶位具有重要的意义。
　　 由于一直缺乏比较有效的体外研究模型,卵巢上皮细胞源性肿瘤的生物学性状和分子特点尚未完全明确。历来的研究都是将卵巢癌细胞在二维条件下培养,存在极大缺陷,会失去很多原本体内的生物学特点,如细胞的蛋白表达、细胞凋亡和侵袭表型等多个方面都会存在较大变化,甚至是发生相反的改变。因此,平面培养获得的肿瘤细胞在很多方面并不能反映出肿瘤组织的真实情况,包括了对药物的反应能力,因此不能完全满足恶性肿瘤体外研究的前提要求。
　　 三维培养体系是近年发展起来并已应用在肿瘤研究的多个领域。本研究跨学科将组织工程中的生物感应器应用于三维培养,形成特征性的旋转式体外细胞培养体系。
　　 本研究第一部分观察到卵巢癌细胞系Skov-3在低剪切力、微重力的三维环境中不断旋转,周围被丰富的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)所包围,细胞与细胞可以充分接触,形成了卵巢癌类组织体。光镜和电镜中所观察的类组织体结构中,清晰地呈现出与卵巢癌组织相似的癌腔结构,与上皮源性卵巢癌组织乳头状或囊腔状生长方式非常接近,是二维培养完全不能模拟的。细胞之间出现紧密连接、缝隙连接、桥粒和半桥粒连接等各种不同连接方式,结构致密。三维培养的卵巢癌细胞所释放的E2和HCG较相同数量级的二维培养明显升高,证实了三维培养使得肿瘤细胞分泌蛋白的能力提高,而且蛋白含量会随着细胞的增殖和细胞间相互作用逐渐上升。此外,三维类组织体的AE1/AE3、Vimenin、cErb-2、ER、HCG等均阳性或强阳性表达,而二维培养的卵巢癌细胞仅有AE1/AE3、Vimenin和cErb-2表达呈弱阳性,进而用免疫组化也证明三维培养能更好地模拟肿瘤组织的蛋白表达。一些与卵巢癌形成和转移相关的重要基因,如EGFR、VEGF、MMP-2、MMP-9、HFR2等,在三维培养的类组织体中表达明显升高,如MMP-2和MMP-9表达均超过4倍。
　　 成纤维细胞是微环境中最重要的优势间质细胞,与肿瘤的侵袭、转移密切相关,是转移前微环境形成的关键,转移病灶产生的基础,因此成纤维细胞的深入研究对阐明肿瘤转移的机制非常必要。本研究第二部分是在先前研究的三维卵巢癌体外研究体系中,加入人成纤维细胞,体外模拟卵巢癌细胞与微环境中优势间质细胞接触式相互作用的环境,分析三维培养条件下卵巢癌细胞及重要间质细胞的生物学行为、分泌特征及基因的改变。
　　 混合三维培养的类组织体外周细胞致密,可见数量众多的癌巢结构,成纤维细胞多数存在于肿瘤细胞密度相对低的部位,证明这种三维混合培养肿瘤实体细胞和间质细胞的模式中,两种细胞可以共存,并相互发生作用。卵巢癌细胞与成纤维细胞相互作用并没有对卵巢癌细胞相关分泌蛋白,如E2和HCG,起到促进作用。免疫组化研究显示,除外上述的AE1/AE3、Vimenin、cErb-2、ER、HCG表达阳性外,胶原Ⅳ、层连蛋白、SMA、Desmin等也不同程度表达阳性。电镜中我们观察到两种不同的成纤维细胞:普通成纤维细胞和肌成纤维细胞。其中肌成纤维细胞具有成纤维细胞和平滑肌细胞的特性,提示类组织体中成纤维细胞被激活,转变为肿瘤相关的成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)。电镜中同时还发现肌成纤维细胞附近可以形成连续、规则的类基底膜结构,成为肿瘤细胞生长依附的支架。虽然,类基底膜结构可以抑制肿瘤细胞的扩散,但这种近乎闭合的基底膜同时又可以成为微血管形成的结构基础,为肿瘤转移提供了重要的物质基础,增加了肿瘤细胞发生微血管转移的风险。
　　 本研究第三部分我们利用RCCS三维培养系统分别构建了3D-Skov-3、3D-HELF和3D-Skov-3+HELF三个不同的类组织体,进行肿瘤转移相关基因的表达芯片(RT ProfilerTM PCR阵列)分析和细胞培养上清液细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和TNF等)检测。芯片结果显示16个基因表达存在差异,上调的基因有KISS1R、MMP10、ITGB3和IL-1B(主要属于抑制肿瘤转移的基因以及促进基质降解的基因)等；下调基因有CXCL12、CDH1、FGFR4、HGF、IL8RB、TIMP3、TIMP4(主要属于促进肿瘤细胞增殖和转移的基因)等。成纤维细胞在混合培养的类组织体中可以改变细胞粘附行为和进行ECM重构,对局部肿瘤侵袭起到促进作用,同时混合三维培养上清液可以促进肿瘤细胞增殖。然而,在成纤维细胞微环境压力下,类组织中的肿瘤细胞基因谱改变却是抑制肿瘤转移,肿瘤细胞的转移处于相对惰性状态。也就是说,成纤维这一单独的间质细胞在卵巢癌细胞与之发生反应的最初阶段或卵巢癌细胞转移至其他脏器的初期,由于CAF比例较少,主要是局部影响肿瘤细胞侵袭作用。因此,我们推测CAF可能是成纤维细胞促进肿瘤侵袭的关键所在。此外,研究也发现成纤维细胞和肿瘤细胞相互作用会导致肿瘤细胞释放大量IL-8,但IL-8与卵巢癌转移的关系还不明确,是否IL-8能够促进CAF的产生值得进行深入探讨。
　　 总之,我们从组织形态、电镜超微结构、细胞特征以及肿瘤相关基因和蛋白表达等方面证明,三维体外培养卵巢癌细胞所获得的类组织体与卵巢癌组织更加接近,明显优越于二维培养这种体外研究体系,并为我们提供了一种研究肿瘤微环境的有效途径。卵巢癌细胞与成纤维细胞混合培养过程中经历了普通成纤维细胞转化成CAF的过程,体现肿瘤细胞与成纤维细胞接触式相互作用的最初阶段的改变,还原了肿瘤发展过程的一个重要环节。未来,我们还可以将血管内皮细胞、巨噬细胞或脂肪细胞等间质细胞分别与卵巢癌细胞共同培养,以明确它们的作用,进而逐步分析肿瘤微环境间质细胞对肿瘤转移的作用。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 构建体外卵巢癌细胞三维培养体系

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 间质成纤维细胞在卵巢癌中作用的初步探讨

引言

材料与方法

结果

讨论

附1

参考文献

第三部分 卵巢癌细胞在成纤维细胞作用的早期阶段的肿瘤转移相关基因谱的改变

引言

材料与方法

结果

讨论

附2

参考文献

结论

综述

参考文献

附录 缩略词

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文