腓骨肌萎缩症家系的分子遗传学研究和Fgf9S99N敲入小鼠模型的表型分析

摘要

第一部分、腓骨肌萎缩症家系的分子遗传学研究
　　 腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)是一类较常见的遗传性周围神经病，群体发病率约为1/2500。该病主要呈常染色体显性遗传(autosomal dominant, AD)，也可呈常染色体隐性遗传(autosomal recessive, AR)及X连锁显性遗传(X-linked dominant, XD)或X隐性遗传(X-linked recessive, XR)。CMT患者在患病初期往往表现出弓形足及杵状指，由于下肢无力而呈现跨越步态。随着疾病的进展，部分患者出现手部肌肉无力和萎缩，造成精细动作困难。末端神经功能的丧失还会导致感觉功能减退，如辨别冷热的能力及触觉下降。该病大多在青少年期起病，也可延迟至中年起病。迄今为止，已报道有43个基因与CMT的发生相关，其中外周髓鞘蛋白22(PMP-22)、髓鞘蛋白零(MPZ)、间隙连接蛋白32(Cx32)异常是导致CMT的常见致病基因。随着研究的不断深入，该病的发病机制得到进一步阐明，为今后的基因诊断和基因治疗奠定了基础。
　　 课题组于2009年7月在山东省采集到一个常染色体显性遗传的CMT大家系，家系成员29人，其中患者8人。在知情同意下，对家系成员进行了详细的体格检查，发现所有患者都表现为不同程度的以下肢为重、并累及上肢的肢体远端肌肉萎缩和无力，但无明显感觉障碍。对先证者行肌电图检查，并行肱二头肌活检。先证者肌电图示上肢运动神经传导速度(MNCV)及感觉神经传导速度(SNCV)均正常(＞52.4m/s)，部分神经复合肌肉动作电位(CMAP)波幅降低；下肢MNCV稍低(38.9~40.4 m/s)，SNCV正常(＞46.4 m/s)，CMAP波幅低平。肌肉活检显示为神经源性肌肉萎缩。根据先证者及其他7名患者的临床表现及先证者电生理检查结果，将该家系诊断为CMT2型。
　　 通过全基因组扫描和连锁分析将该家系致病基因定位于10p13-14，其中D10S506最大Lod值为4.56。由于该区域无已知致病基因的报道，即采用候选基因法对位于D10S585与D10S1477之间的20个基因逐一进行序列分析，结果发现DHTKD1基因第8外显子cDNA序列1455个核苷酸由T 变为G，导致该三联密码子编码的氨基酸由丝氨酸变为终止密码子。体外实验证明，截断的蛋白质会造成mRNA稳定性的下降，由此产生的单倍型不足效应造成正常蛋白质量的减少，从而引起临床表型。由于DHTKD1是三羧酸循环关键酶α-酮戊二酸脱氢酶复合体E1k的组分，故推测该基因的突变会导致α-酮戊二酸脱氢酶活性的改变，进而影响下游产物琥珀酸辅酶A及NADH的产生。体外实验提示，DHTKD1基因突变造成的截断蛋白不能正常行使酶复合体的功能，使E2k和E3k无法正常与E1k结合，导致ATP及NADH的产量减少，并且在共聚焦显微镜下观察到线粒体氧化还原能力下降，细胞形态改变。由此推测DHTKD1基因的改变会对三羧酸循环造成影响，从而干扰了能量的正常产出，致使线粒体出现功能性的改变及能量供给的不足。当然，神经细胞供能的不足是否是导致神经轴突无法传递神经冲动并造成远端靶目标肌肉萎缩的原因，仍需证明。简言之，该项研究为进一步阐明DHTKD1基因的生物学功能及该基因突变导致腓骨肌萎缩症的机制提供了新的方向，也为该病的早期诊断和基因治疗奠定了分子基础。
　　 第二部分、Fgf9 S99N敲入小鼠模型的表型分析
　　 多发性骨性连接综合征(multiple synostosis syndrome, SYNS)是一类以多处关节强直或融合为主要表现的常染色体显性遗传病。儿童期即可发病，并呈进行性发展，最后发展为关节骨性融合。已报道的多发性骨性连接综合征有3种类型，前2种分别为由NOG基因突变引起的SYNS1 型(MIM 186500) 和由生长分化因子5 (growth/differentiation factor-5, GDF5) 基因突变引起的SYNS2型(MIM610017)。第3种类型是由成纤维细胞生长因子9(fibroblast growthfactor 9, FGF9)基因突变所致，该突变是本课题组在对青海省一个由五代共56人组成的SYNS大家系进行了基因组扫描、连锁分析和测序分析后发现的，故命名为SYNS3型。
　　 FGF9是成纤维细胞生长因子家族(FGFs)的成员之一，由208个氨基酸组成。研究表明，FGF9在人胚胎发育时期及整个生命过程中发挥重要作用。体外实验提示突变FGF9通过影响软骨细胞的增殖及终末分化，进而影响软骨内骨化的过程。为进一步研究FGF9 在SYNS3型发生中的作用，课题组建立了Fgf9 S99N敲入小鼠模型，以研究突变FGF9对关节发育、软骨增殖与分化的作用，进而解释由错义突变所导致的FGF9基因的生物学功能变化以及SYNS3型出现多发性骨性融合的可能机制。
　　 本研究针对Fgf9 S99N 敲入小鼠模型出现的表型，通过RT-PCR和Western blot方法对基因敲入小鼠进行检测，证实定点突变小鼠构建成功且未引起外显子异常剪切。利用免疫组化以及钼靶成像和MicroCT 等放射学检测手段发现基因敲入小鼠骨关节发育存在异常，其中小鼠尾椎关节出现融合，膝关节出现无菌性骨关节炎，颌面部发育不对称。这些表型有助于研究FGF9 基因突变导致人软骨发育不全等人类骨骼发育缺陷疾病的机制。此外，FGF9主要与成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor, FGFR)家族成员结合，而其中的FGFR2和FGFR3突变能引起软骨发育不全、软骨发育不足等一系列人类骨骼发育缺陷疾病。为此，本课题还研究了Fgf9和小鼠Fgfrs之间的关系，发现Fgfr1、Fgfr2、Fgfr3和Fgfr4在成年小鼠骨关节中均有表达，其中Fgfr1和Fgfr4在小鼠骨关节发育阶段起主要作用，Fgfr2和Fgfr3在小鼠关节的维持阶段起主要作用。
　　 总之，Fgf9 S99N敲入小鼠模型的建立及表型分析有助于揭示SYNS3型的致病机制。

目录

第一部分 腓骨肌萎缩症家系的分子遗传学研究

第二部分 Fgf9 S99N敲入小鼠模型的表型分析

结 论

综 述腓骨肌萎缩症的遗传特征及致病机制的研究进展

致 谢

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