干细胞技术的快速发展为传统医疗手段束手无策的疾病重新燃起了希望，而患者自身体细胞重编程而来的多能干细胞的问世更是加速了干细胞在再生医学领域的应用步伐。目前获得多能干细胞的途径主要有：一、诱导多能干细胞（iPS），近些年iPS虽已取得突破性进展，但其产生主要通过导入外源转录因子，存在强烈的致瘤性、分化难以控制、重编程机制不清等问题，导致离临床应用尚存较远距离；二、胚胎干细胞（ES细胞），包括人体外受精囊胚来源的ES细胞与体细胞核移植（SCNT）来源的ES细胞（即ntES）；但人体外受精囊胚来源有限且用于研究存在伦理问题，因此ntES成为研究热点。体细胞被重编程至全能状态是经历细胞结构、染色体表观遗传修饰、转录及转录后调控因子表达等渐进性与建筑性重塑的结果，目前保证体细胞获得稳定重编程状态的这种和谐性重塑主要通过卵子或合子胞浆提供的微环境获得。但人卵母细胞来源极其有限且用于研究领域是一种对社会伦理道德的严重挑战，因此为避免该伦理道德约束，采用动物卵母细胞或人体外受精周期产生的废弃卵胞质进行人体细胞重编程研究是一值得探索的问题。故本研究分别采用山羊卵母细胞、人多精受精卵为胞质受体，进行人种间与种内体细胞核移植研究，以期建立人体细胞核移植技术平台、获得人体细胞核移植来源胚胎干细胞。本研究分为两部分，即：人-羊种间核移植重构胚发育潜能、人多精受精卵来源核移植重构胚发育潜能，研究结果如下： 第一部分：人-羊种间核移植重构胚发育潜能。为探索人体细胞核移植技术平台建立方法，以去核的山羊卵母细胞为胞质受体，人皮肤成纤维细胞为核供体，构建人-羊种间核移植重构胚，经电融合、化学激活后包埋移植到山羊输卵管内行体内培养；6天后，共回收重构胚209枚，其中正常卵裂期胚胎127枚，桑椹期胚胎11枚，囊胚8枚，囊胚获得率3.83℅。机械法分离8枚囊胚的内细胞团细胞接种培养，其中5枚接种48小时后贴壁，4枚形成了不典型的原代集落，1枚形成了典型的hESC样原代集落；采用改良人胚胎干细胞培养液分离培养后，现已传20代次，且表达人正常胚胎干细胞的多能标志物如AKP,Oct4,Nanog等。但该细胞集落尚存多能性不足与极易自发分化的特性；采用人cep2,cep6,tel2特异位点探针结合FISH检测该囊胚滋养外胚层细胞，结果显示人正常二倍体信号。 第二部分：人多精受精卵来源核移植重构胚发育潜能。在人-羊种间核移植技术平台基础之上，采用人体外受精周期产生的多精受精卵为胞质受体，同期颗粒细胞为核供体，构建人种内核移植重构胚。共收集67例患者的128枚多精受精卵，对其中30枚新鲜与5枚冻融3PN合子初次进行了去核与移核，结果成功去核26枚（74.29％），移核25枚（96.15％）。采用5组不同的电融合参数进行融合，结果147V、20ms、电刺激2次融合成功率最高（90.0％ vs 33.3％ vs 0％ vs 0％ vs 0％）；共融合成功11枚（44.0％）。采用人卵裂期胚胎培养液P-1培养后，获得原核期胚胎5枚（45.45％），2-C胚胎3枚（27.27％），6-C胚胎1枚（9.09％）。采用人13q14.2,21q22.13特异位点探针对1枚原核期与1枚2-细胞期胚胎进行FISH检测，均显示人正常二倍体信号。 研究表明：⑴山羊卵母细胞能使人体细胞核进行适当的重编程，使人体细胞重返至胚胎状态并发育至囊胚，分离囊胚ICM可形成hESC样集落，但该集落细胞易自发向神经谱系细胞分化，形成的神经元样细胞具神经元功能，提示利用人种间核移植技术可获得具备正常生理功能的细胞；⑵人多精受精卵可成功用作人体细胞核移植胞质受体，但重构胚若发育至囊胚，尚需优化体细胞核移植技术及胚胎体外培养系统；⑶采用特异位点探针结合FISH技术分析囊胚滋养外胚层细胞可在早期评估胚胎染色体状态，排除染色体异常胚胎，避免后续资源浪费。
展开▼
