β淀粉样前体蛋白羧基端肽(APPC31)在阿尔茨海默病中致病作用的实验研究

摘要

目的：体外探讨β淀粉样前体蛋白羧基端肽（APPC31）在阿尔茨海默病（Azleimer’s disease, AD）中的毒性作用及机制，为进一步探讨AD的发病机制和治疗方法提供理论基础和实验依据。
　　 方法：采用分子克隆实验方法构建pIRES2-EGFP-APPC31 、pEGFP-C2-APP△C31 真核过表达质粒。采用脂质体法分别将过表达的空载体质粒、野生型APP695 质粒、APP（D664A）质粒、APP 氨基端长肽(APP△C31)质粒和APPC31 质粒瞬时转染Neuro2a 细胞。采用细胞免疫荧光方法验证质粒成功转入细胞并表达目的蛋白。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法观察质粒APPC31 转染入Neuro2a 细胞48h 后的细胞活力,和不同浓度的β淀粉样蛋白（Aβ42）作用24h 后的Neuro2a 细胞活力，以及转染各组质粒24h 后与Aβ42(10μM)共孵育24h 的Neuro2a 细胞活力。通过DAPI 核染色观察细胞核形态，与空载体转染细胞组对照，观察Aβ42 处理下APPC31 的致细胞毒性作用。通过Western blotting 方法，检测Aβ42（10μM）作用Neuro2a 后Tau 蛋白磷酸化水平，及质粒APPC31转染入Neuro2a 细胞36h 后和瞬时转染各组质粒后24h 与Aβ42共孵育12h时的Tau 蛋白磷酸化水平变化。用GSK3β抑制剂LiCl 分别处理转染野生型APP695 质粒及APPC31 质粒的细胞，与Aβ42(10μM)共孵育12h 后，采用Western blotting 方法检测其Tau 蛋白磷酸化水平的变化。
　　 结果：在未与Aβ42 共孵育时，空载体质粒转染组和APPC31 质粒转染组Neuro2a 细胞的活力无明显差异（P>0.05）；在Aβ42（10μM）共孵育条件下，无转染组、空载体质粒组、野生型APP695 质粒组、APP（D664A）质粒组和APPC31 质粒组Neuro2a 细胞活力与空载体质粒组对比，野生型APP695 质粒组及APPC31 质粒组细胞活力明显下降（P<0.05）,且细胞核呈现明显浓缩、染色加深改变。Aβ42 所致Tau 蛋白在Ser396、199 位点的磷酸化呈时间依赖性,在12h 时磷酸化水平最高；
　　 Aβ42 致APP、APPC31 过表达细胞中Tau 蛋白在Ser396 位点的磷酸化水平显著升高(P<0.05）同时这种磷酸化水平被GSK-3β抑制剂LiCl 显著抑制（P<0.05），提示在野生型APP 及APPC31 过表达的Neuro2a 细胞中，GSK-3β参与了APPC31 增强的Tau 蛋白在Ser396 位点磷酸化水平的升高。
　　 结论：体外Neuro2a 细胞研究中，单独过表达一定水平的APPC31并不具有细胞毒性；但此短肽可增强Aβ42 的致细胞毒性作用。且此短肽可通过增强GSK-3β诱导的Tau 蛋白在Ser396 位点磷酸化水平来增强Aβ42 的细胞毒性作用。为进一步明确其发病机制提供了一定的理论基础和实验依据。

目录

前 言

第一部分 pIRES2-EGFP-APPC31、pEGFP-C2-APP△C31 真核过表达质粒的构建、转染及表达

第二部分 APP 羧基端肽（APPC31）对小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro2a）的毒性作用

第三部分 APPC31 增强Aβ42 毒性作用机制的探讨

结 论

参考文献

致 谢

附录1综述 淀粉样前体蛋白降解产物在阿尔茨海默病中致病作用的研究进展

附录2 攻读学位期间发表文章

论文说明:缩略语词表

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