阿尔茨海默病中β淀粉样前体蛋白羧基端短肽C31与自噬的相关性研究

摘要

目的：
　　阿尔茨海默病(AD)的发病机制尚未明确，目前主流的观点包括Aβ和Tau蛋白学说。然而β淀粉样前体蛋白(APP)除了产生Aβ外，尚可产生其它的多肽片段而参与AD的发病，这其中包括APP羧基端片段C31。C31是经由Caspase在APP第664位位点剪切后产生的短肽，其包含了31个氨基酸片段。已有研究表明，C31具有潜在的神经毒性作用，与AD密切相关。自噬，作为细胞内一种清除不必要的或功能失调的细胞组分的基本代谢途径，在AD发病过程中同样扮演着重要的角色。本研究首次探讨了C31的毒性作用和自噬的关系，以及自噬是否介导C31的清除。
　　方法：
　　首先构建了p3xFLAG-CMV-10-mCherry(Vector)质粒，然后以此质粒为载体构建了p3xFLAG-CMV-10-mCherry-C31(C31)目的质粒。采用脂质体转染法转染入不同的细胞系中，并通过蛋白印迹方法(western blot)分别在不同细胞细胞系，包括SH-SY5Y和APPsw稳转的HEK293细胞(APPsw HEK293)中验证其表达；采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测C31和对应的空载质粒瞬时转染入SH-SY5Y和APPsw HEK293细胞48 h后的细胞存活率；分别予促自噬(Rapamycin和Starvation)，下调自噬(3-MA)以及加入自噬溶酶体抑制剂(CQ和NH4Cl)作用于细胞，采用western blot方法检测自噬相关蛋白(LC3)水平和C31水平。最后，通过免疫共沉淀法，检测C31是否可以和LC3结合，并且采用免疫荧光方法检测C31在细胞内的位置，观察其是否可以与LC3共定位，以进一步验证自噬是否是介导C31降解的关键途径。
　　结果：
　　在SH-SY5Y和APPsw HEK293细胞系中，C31质粒转染组细胞活力显著低于空载体质粒转染组(P<0.05)。在SH-SY5Y和APPsw HEK293细胞中，转染C31组和对照组相比，自噬水平无明显差异；促自噬情况下(Rapamycin和Starvation)，LC3-II的水平比未加药处理组略增高，但未达到统计学意义，C31水平相对于空载水平无统计学差异；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于APPsw HEK293细胞后，LC3-II水平有轻度降低，但未达到统计学意义，C31水平相对于空载水平也未达到统计学意义；加入自噬体和溶酶体融合抑制剂，也即终末抑制剂，氯喹(CQ)和氯化铵(NH4Cl)后，细胞自噬的水平相对于未加药处理组，有明显的增高，且CQ的作用最为明显，C31水平相对于空载水平明显增高。在SH-SY5Y细胞中，结果类似，但CQ和NH4Cl作用后，C31水平相对于空载水平无统计学差异。C31能够促使SH-SY5Y和APPsw HEK293细胞中APP表达水平升高。C31通过与自噬相关蛋白LC3结合，从而锚定到自噬体上，而参与到自噬代谢过程。
　　结论：
　　C31在SH-SY5Y细胞和APPsw HEK293细胞中均能产生明显的细胞毒性作用。过表达C31能够促进细胞中APP水平增高，但不改变细胞的自噬水平。自噬通过自噬相关蛋白LC3与C31的相互作用，从而介导C31的清除，表明自噬可能在阿尔茨海默病中起到保护作用。本研究为进一步明确AD的发病机制及其治疗途径提供了一定的实验依据。

目录

声明

缩略语表

前言

第一部分 p3xFLAG-CMV-10-mCherry质粒和p3xFLAG-CMV-10-mCherry-C31质粒的构建、转染及其表达

前言

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分 C31对SH-SY5Y和APPsw HEK293细胞活力的影响，及自噬和C31的相互作用

前言

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分 调整自噬水平对C31水平的影响及自噬对C31水平调控的可能机制

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述:自噬在阿尔茨海默病中的作用机制及其治疗前景

致谢