病毒宏基因组学分析儿童和猪肠道病毒群落及23株病毒的初步研究

摘要

新发病毒性传染病危害人和动物的健康。挖掘和鉴定新病毒是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务。病毒宏基因组学是在宏基因组学的基础上发展起来的一门研究特定环境中病毒群落的新兴技术。该技术已经被广泛地应用到挖掘新病毒，并且取得可喜的成就。腹泻是各个年龄段的人群中常见的疾病，也是影响养猪业经济效益的主要疾病之一。在世界范围内，每年有将近15亿人腹泻，其中儿童和年长者发病率高；有200多万5岁以下腹泻儿童死亡，并且发展中国家占有较大的比例。目前，现有的检测技术只能诊断出60％的腹泻病例的病因，而近40%的病例查不出病因。引起未知病因的腹泻的致病因素，可能是目前暂未被发现的病毒。猪作为经济动物，为人类提供了大量的肉类，同时也是携带人兽共患病的宿主。腹泻是仔猪的常发疾病，给养猪业造成严重的经济损失。
　　我国是发展中国家。腹泻是影响我国人民的健康主要疾病之一，尤其是儿童的健康。分析腹泻儿童粪便中的病毒群落和发掘潜在的新病毒将为诊断不明腹泻的病因提供新的途径。克隆新病毒的基因组和流行病学调查将为预防和治疗新病毒引起的腹泻奠定基础。养猪业在世界养殖业占有重要的地位。预防和控制猪病是提高养猪效益的最好的解决办法，同时也是控制猪源性人兽共患病的有效途径。研究腹泻猪和健康猪粪便中的病毒群落及挖掘潜在的新病原，将为诊断猪病毒性疾病提供可靠的资料；克隆猪源性新病毒的基因组和流行病学调查将为预防和治疗猪病毒性疾病奠定基础。
　　本论文主要研究内容和结果如下：
　　（一）病毒宏基因组学分析人和猪粪便中的病毒群落
　　（1）病毒宏基因组学分析腹泻儿童粪便中的病毒群落
　　本实验应用病毒宏基因组学方法，构建了12份上海腹泻儿童粪便中病毒群落的文库，通过 sanger测序法分析了总文库中的840个克隆。结果显示：在上海腹泻儿童粪便文库中，31.4%的序列匹配到病毒，5.8%的序列匹配到噬菌体，2%的序列匹配到细菌和60.7%的序列是未知序列；病毒序列主要匹配到肠道病毒、博卡病毒、星状病毒、Aichi virus、双埃克病毒、Human coavirus和Klassevirus/Salivirus；
　　（2）病毒宏基因组学分析我国猪群粪便中的病毒群落
　　本实验应用病毒宏基因组学方法，构建了17份我国猪粪便中病毒群落的文库，通过sanger测序技术分析了总文库中的1190个克隆。结果显示：32.9%的序列匹配到真核病毒，7.0%的序列匹配到噬菌体，2.2%的序列匹配到细菌和57.9%的序列没有匹配到任何序列。病毒序列匹配到得猪肠道病毒、博卡病毒和星状病毒。
　　（3）病毒宏基因组学分析美国猪群粪便中的病毒群落
　　本实验应用病毒宏基因组学方法，通过454高通量测序分析美国18个健康猪和18个腹泻猪粪便中病毒群落文库。结果显示：该文库包含652,614个序列，最小测序长度为40bp，最大测序长度为699bp，测序平均长度为236bp。去除引物标签后，文库中的有效序列大于57万条，平均长度为192bp。序列比对结果显示：0.2%的序列匹配到真核基因、0.2%的序列匹配到其他序列、9%的序列匹配到细菌、10%的序列匹配到噬菌体、13%的序列是未知序列及68%的序列匹配到病毒。病毒序列匹配到肠道病毒、Sapelovirus、星状病毒、Kobuvirus、Sapovirus、Teschovirus、环状类病毒、博卡病毒和Rosavirus。
　　（二）23株病毒的初步研究
　　（1）6株星状病毒的初步研究
　　本实验克隆了上海第一株HAstV1的基因组，其大小为6808bp。分析ORF2的核苷酸系统进化树，结果显示本分离株与日本分离株AB000285比较相近。通过RT-PCR检测了上海腹泻儿童的279份样品，结果显示：HAstV感染率为8.2%，主要为HAstV1。
　　本实验克隆了我国第一株 PAstV的基因组，其大小为6610bp。分析 ORF2编码的氨基酸的系统进化树，结果显示：本株PAstV属于PAstV1。通过RT-nPCR检测了来自我国5省市的340份猪粪便样品，结果显示有 PAstV1感染率为22.9%。
　　本实验克隆了美国猪群中4株新的PAstVs（PAstV2-43、PAstV2-51、PAstV4-35和PAstV5-33）。分析ORF2编码的氨基酸的系统进化树，结果显示：PAstV2-43和PAstV2-51属于PAstV2，与加拿大的聚为一支；PAstV4-35属于PAstV4，与匈牙利的聚为一支；PAstV5-33单独聚为一支，并且其与所有已知的AstV的氨基酸同源性都小于26%，其可能为PAstV的一个新种。
　　（2）2株HPeVs的初步研究
　　通过RT-nPCR检测了220份上海腹泻儿童样品和116份腹泻猴粪便样品中的HPeVs。结果显示：上海腹泻儿童粪便中的HPeVs的阳性率为20.5%；腹泻猴粪便中的阳性率为5.2%。本研究首次在猴粪便中发现HPeV。
　　本实验克隆了我国第一株HPeV1的基因组，其大小为7259bp。系统进化树分析P1区核苷酸序列结果显示该株与德国株（EF051629）和荷兰株（FM178558）的HPeV1聚为一支。克隆了来自猴粪便中的第一株HPeV6的基因组，基因组大小为7311bp。系统进化树分析 HPeV6的全基因组结果显示该株和日本株（AB252582）和荷兰株（EU077518）聚为一支。
　　(3) Salivirus/Klassevirus的初步研究
　　本实验克隆了我国第一株Salivirus/Klassevirus的基因组，其大小为7798bp。系统进化树分析P1区氨基酸结果显示该株与已报道的Salivirus/Klassevirus聚为一支。该可能病毒为picornaviridae中一个新的属。
　　通过RT-nPCR检测了216份上海腹泻儿童样品和96份健康儿童样品。结果显示上海腹泻儿童粪便中的Salivirus/Klassevirus的阳性率为4.2%。通过数理统计结果显示：Salivirus/Klassevirus和腹泻的关联分析差异显著（p=0.03）。结果表明该病毒可能引起腹泻。
　　（4）8株博卡病毒的初步研究
　　本实验克隆了我国2株HBoV1的基因组和1株HBoV2，它们的基因组大小分别为：5288bp、5277bp和5244bp。系统进化树分析HBoV1和HBoV2的基因组，结果显示 HBoV1与我国已报道的分离株聚为一起，HBoV2与巴基斯坦（FJ170279）分离株聚为一起。通过PCR检测了上海腹泻儿童的320份样品，结果显示HBoV1和HBoV2的阳性率分别为5.3%和5.0%。
　　通过PCR检测来自上海3家宠物医院的158份腹泻犬的粪便样品，结果显示一个样品为 CnMV阳性。根据美国株（FJ214110）的基因组设计引物，克隆了我国第一株CnMV的基因组，其大小为5132bp。
　　通过基因组步移，本实验克隆了我国2株PBoV（PBoV1-H18和PBoV2-A6），它们的基因组大小为5267 bp和5117 bp。系统进化树分析了全基因组和3个基因的核苷酸和氨基酸序列结果显示PBoV1-H18与猪boca-like virus聚为一支，而PBoV2-A6与PBoV1（HM053693）和PBoV2（HM053694）聚为一起。流行病学调查结果显示PBoV1-H18和PBoV2-A6阳性率高达75%和70.1%。
　　本实验克隆了美国2株PBoV3的基因组，其大小为4710bp和4689bp。系统进化树分析VP1蛋白结果显示：PBoV3与6V和7V聚为一支。初步推测PBoV可能存在3个种（PBoV1、PBoV2和PBoV3）。
　　（5）4株Po-Circo-like Virus的初步研究
　　本实验克隆了4株新的Po-Circo-like Viruses，其基因组大小分别为3912bp、3923 bp、2904bp和2833bp。系统进化树分析了Rep蛋白，结果显示：4株Po-Circo-like Viruses聚为一支，其可能是环状病毒家族中一个新的属。这4株环状类病毒基因组中含有的特征结构为：茎环结构和Rep蛋白的保守区域（viral Rep和RNA helicase）。
　　（6）Posavirus1和Posavirus2的初步研究
　　本实验克隆了2株微小 RNA病毒超级家族中新的成员，暂且命名为Posavirus1和Posavirus2。其基因组大小为9816bp和10191bp。根据不同宿主的单链RNA病毒的碱基排列规律划分，posavirus1和posavirus2被划分到昆虫区域范围内。系统进化树分析 RNA病毒的RdRp区域，结果显示 posavirus1和posavirus2分别单独聚为两支。初步推测posavirus1和posavirus2可能为微小RNA病毒超级家族中的新的不同科或属。通过RT-nPCR检测36份猪的样品。结果显示posavirus1和posavirus2阳性率分别为47.2%和30.6%。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 引言

1.研究背景

2.文献综述

2.1. 宏基因组学

2.2. 新一代测序技术

2.3．挖掘新病毒的方法

2.4. 新发现病毒的研究进展

2.5.小结

3.研究目的和意义

4. 全文技术路线

第二章 宏基因组学分析人和猪粪便中的病毒群落

1. 材料

1.1载体和菌株

1.2 试剂盒和酶

1.3 主要试剂及配制

1.6样品采集

2方法

2.1 儿童粪便中病毒群落的筛选

2.2 中国猪粪便中病毒群落的筛选

2.3 美国猪粪便中病毒群落的筛选

3.结果

3.1分析上海腹泻儿童粪便中病毒群落

3.2分析中国猪粪便中病毒群落

3.3 美国猪粪便中病毒群落

4.讨论

5小结

第三章 23株病毒的初步研究

1. 材料

1.1载体和菌株

1.2 试剂盒和酶

1.3 主要试剂及配制

1.4主要仪器设备

1.5分子生物学软件及数据库

1.6实验样品

2.方法

2.1样品的处理

2.2 遗传物质的提取

2.3 星状病毒的初步研究

2.4 人双埃克病毒的初步研究

2.5 Salivirus 的初步研究

2.6 博卡病毒的初步研究

2.7 猪Circo-like Viruses的初步研究

2.8 Posavirus1和Posavirus 2的初步研究

3.结果

3.1星状病毒

3.2 HPeV初步研究

3.3 Salivirus/Klassevirus的初步研究

3.4 博卡病毒的初步研究

3.5 Po-Circo-like Viruses的初步研究

3.6 Posavirus 1和Posavirus 2的初步研究

4.讨论

5.小结

全文总结及创新点

参考文献

在读博士期间已发表的文章和待发表的文章

致谢

声明

上海交通大学学位论文答辩决议书