金黄色葡萄球菌临床分离株的基因分型与毒素基因多样性

摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的临床和食源性致病菌，20-40％的健康人群的皮肤或粘膜表面都有金黄色葡萄球菌寄居，存在很高的潜在感染性。金黄色葡萄球菌可以分泌多种引发人类疾病的毒力因子，例如，有些菌株能够产生毒性休克综合征毒素(toxicshock syndrome toxin，TSST);有些菌株能够产生引起皮肤感染的表皮剥脱毒素(exfoliatin toxin，ET);而有些菌株能够表达耐热的肠毒素(staphylococal enterotoxin，SE)。这三大类毒素是金黄色葡萄球菌最重要的致病因子，能够引起中毒性休克综合征、皮肤感染和化脓及胃肠炎等，而且编码这些毒力因子的基因大多数位于金黄色葡萄球菌携带的可移动基因元件上，可通过水平转移传播，增强金黄色葡萄球菌的致病力和遗传多样性。因此，分析不同背景来源的金黄色葡萄球菌携带的毒素基因多样性，结合基因分型结果，为明确流行环节、追踪传染源、切断传播途径，从而为减少和控制感染奠定理论基础。因此，本论文的主要研究内容及结果如下:
　　1、利用特异性扩增PCR调查了22种毒素基因在中国14个城市16家不同医院分离得到的108株金黄色葡萄球菌临床分离菌株中的多样性分布，包括18种肠毒素基因sea-see、seg-ser、seu，3种表皮剥脱毒素基因eta、etb、et及中毒性休克综合征毒素基因tsst。结果显示，高达90.7％的金黄色葡萄球菌菌株都携带毒素基因，包含47种不同的毒素基因组合（即毒素基因型），其中80株菌株携带两种或两种以上不同种类的毒素基因，2株菌株携带多达12种不同种类毒素基因;携带率最高的毒素基因是tsst(48.1％)，其次分别是sea(44.4％)，sek(42.6％)，和seq(40.7％)，而see和etb没有检出;某些特定的毒素基因组合如sea-sek-seq、egc等在金黄色葡萄球菌菌株中的高检出率，揭示了毒素基因的高度多样性和可移动基因元件在菌株间的频繁转移;除seb，seu和eta只在MSSA菌株中检测到外，其他毒素基因在MRSA和MSSA菌株中均有分布，而且所有MRSA菌株都是毒素基因阳性菌株。
　　2、利用多位点序列分型(MLST)评价了108株金黄色葡萄球菌临床分离株的遗传多样性，获得了25个不同的序列型(STs)。它们分布在16个不同的克隆系(CCs);除ST120和11个新的ST外，其他序列型都包含两株或两株以上菌株;ST239是分布最广的一个序列型，对应的CC239是本研究中最大的克隆系，包含ST239和两个新的ST(1923和1924);所有CC239中的35株金黄色葡萄球菌都是MRSA，其他4株MRSA属于CC5;另外得到了7个新的等位基因和11个新的STs，已分别提交至GenBank和MLST数据库，并被接受;6个已知ST型(ST6，7，15，25，120，630)首次在中国地区来源的金黄色葡萄球菌中发现，补充了中国地区来源的金黄色葡萄球菌的MLST数据库信息。
　　3、为了进一步分析金黄色葡萄球菌分离株的遗传多样性及与地域来源的相关性，利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对108株金黄色葡萄球菌分离株进行了分型。PFGE结果使用BioNumerics软件分析，在80％相似度的基础上，采用Dice coefficients and UPGM构建进化树，将分离株分为25个不同的PFGE型;一些样品来源相同的金黄色葡萄球菌分离菌株被聚类到不同的PFGE型;而一些不同样品和地区来源的金黄色葡萄球菌分离菌株被聚类到相同的PFGE型;在25个PFGE型内，有18个PFGE型包含两个或更多不同医院来源的金黄色葡萄球菌分离株，17个PFGE型包含两类或更多类临床样品来源的金黄色葡萄球菌分离株;39株MRSA分布在6个不同PFGE型，而69株MSSA分布在多达19个不同的PFGE型。这些结果还难以揭示PFGE型与菌株的地域来源及甲氧西林耐药性之间的密切相关性。
　　4、agr是金黄色葡萄球菌中大多数毒力基因的调控因子，为了探究agr型与毒素基因间是否存在相关性，利用多重PCR方法对108株金黄色葡萄球菌分离株进行了agr基因分型。结果显示，四种agr基因型在108株金黄色葡萄球菌中均有分布，其中agrⅠ型菌株所占比例最高(60.2％)，接下来是agrⅢ型(19.4％)、agrⅡ型(16.7％)、agrⅣ(2.8％)、一株金黄色葡萄球菌agr PCR扩增阴性;agr基因型与毒素基因之间未显示出相关性;而agr型与MLST型之间有密切相关性，每一个MLST型对应单一agr型。
　　5、从108株金黄色葡萄球菌分离株中随机选取了52株进行全自动核糖体分型(Ribotyping)，并将其结果与MLST和PFGE分型结果进行比较，使用辛普森指数比较三种基于不同原理的分型方法的分辨能力。结果显示，核糖体分型得到29个唯一的核糖型，其辛普森指数为D=0.965;PFGE聚类得到20个唯一的PFGE型，其辛普森指数为D=0.949; MLST得到17个序列型，其辛普森指数为D=0.937。从辛普森指数值可以看出，核糖体分型的分辨能力最强。
　　6、比较分析了47种毒素基因型与PFGE和MLST分型结果，并讨论了它们所反映的遗传背景之间的相关性。结果显示，在相同的PFGE型或MLST克隆系内的金黄色葡萄球菌菌株携带不同的毒素基因型，携带的毒素基因种类从1-12种不等，与菌株的遗传背景之间未显示出密切相关性;除了71％携带sea-sek-seq的菌株来源于两家医院并且属于相同的MLST克隆系239内，大部分MLST克隆系或PFGE型含有一种以上不同的毒素基因型，揭示了毒素基因型更具多样性。
　　7、利用酶联免疫试剂盒检测了五种传统肠毒素SEA-SEE，并利用反转录PCR(RT-PCR)在mRNA水平上对18种肠毒素基因(sea-see，seg-ser，seu)进行了表达检测;同时，利用反转录荧光定量PCR，在mRNA水平上研究了不同肠毒素基因及其在不同环境条件下的相对表达差异。结果显示，传统肠毒素的检测和肠毒素基因在mRNA水平的表达检测结果均与PCR检测结果一致;不同肠毒素基因间相对表达存在差异，携带肠毒素基因的菌株间毒素基因的相对表达水平也存在差异，从mRNA水平上揭示了金黄色葡萄球菌分离株的多样性。
　　8、利用变换傅里叶衰减全反射红外光谱技术，以14株非葡萄球菌属标准菌株，3株葡萄球菌属标准菌株和84株葡萄球菌属临床分离株为实验菌株，结合统计方法，采用两步法正确鉴定了金黄色葡萄球菌，通过内部验证和外部验证考察了所建模型的鉴定能力。第一步，在波段1800-1050cm-1范围，利用非监督型方法HCA，正确鉴定了38株金黄色葡萄球菌，但是有20株金黄色葡萄球菌被错归为溶血葡萄球菌;第二步，利用监督型方法PLSR、PCR(+)正确鉴定了金黄色葡萄球菌和溶血葡萄球菌，并且比较了不同的数据处理方法对模型鉴定能力的影响。

目录

声明

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 金黄色葡萄球菌与食品安全

1．2 金黄色葡萄球菌生物学特性

1．2．1 基本特征

1．2．2 流行病学

1．2．3 致病性

1．2．4 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

1．3 金黄色葡萄球菌的毒力因子

1．3．1 肠毒素的命名

1．3．2 肠毒素的结构

1．3．3 肠毒素基因的位置

1．3．4 肠毒素与食物中毒爆发

1．3．5 表皮剥脱毒素

1．3．6 中毒性休克综合征毒素

1．4 金黄色葡萄球菌毒素的检测

1．4．1 动物实验

1．4．2 免疫学方法

1．4．3 分子生物学方法

1．5 金黄色葡萄球菌的基因分型

1．5．1 脉冲场凝胶电泳

1．5．2 辅助基因调节因子分型

1．5．3 金黄色葡萄球菌表面蛋白A基因多态性分型

1．5．4 多位点测序分型

1．5．5 多位点数目可变串联重复序列指纹图谱分型

1．5．6 随机扩增DNA的多态性分型

1．5．7 核糖体分型

1．6 傅里叶红外光谱在微生物分型鉴定中的应用

1．6．1 红外光谱技术对微生物进行分类、鉴别和检测的原理

1．6．2 红外光谱技术在微生物分类鉴别研究中的应用

1．6．3 红外光谱技术在微生物研究中的应用前景

1．7 研究的目的及意义

第二章 金黄色葡萄球菌毒素基因的多样性分析

2．1 材料

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂及配置

2．1．3 仪器设备

2．2 方法

2．2．1 金黄色葡萄球菌的活化

2．2．2 金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取

2．2．3 金黄色葡萄球菌的分子鉴定

2．2．4 金黄色葡萄球菌肠毒素的同源性比对

2．2．5 金黄色葡萄球菌毒素基因的PCR检测

2．2．5 肠毒素基因seu的验证

2．2．6 毒素基因序列测序验证

2．3 结果与分析

2．3．1 金黄色葡萄球菌肠毒素的同源性比对

2．3．2 金黄色葡萄球菌毒素基因的多样性分布

2．3．3 金黄色葡萄球菌的毒素基因型

2．4 讨论

第三章 金黄色葡萄球菌的基因分型

3．1 材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要培养基的配制

3．1．4 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 多位点序列分型

3．2．2 脉冲场凝胶电泳

3．2．3 agr基因分型

3．2．4 核糖体分型

3．3 结果与分析

3．3．1 金黄色葡萄球菌序列多样性分析

3．3．2 PFGE分型

3．3．3 agr基因分型

3．3．4 核糖体分型

3．3．5 毒素基因与遗传背景之间的相关性

3．3．6 遗传多样性与地域分布之间的相关性

3．3．7 agr基因分型与毒素基因类型之间的相关性

3．3．8 不同分型方法的比较

3．4 讨论

第四章 金黄色葡萄球菌肠毒素的检测及差异表达分析

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 主要试剂及配置

4．1．4 仪器与设备

4．2 方法

4．2．1 传统肠毒素的检测

4．2．2 金黄色葡萄球菌培养条件和总RNA提取

4．2．2 金黄色葡萄球菌cDNA的合成

4．2．3 肠毒素的表达检测

4．2．4 肠毒素基因的相对表达

4．2．5 Real time PCR标准曲线制作

4．2．6 不同生长阶段肠毒素基因的相对表达

4．2．7 不同培养温度对金葡肠毒素基因表达影响

4．2．8 人工污染牛奶样品肠毒素相对表达

4．2．9 不同肠毒素基因间的相对表达

4．3 结果与分析

4．3．1 肠毒素SEA-SEE的检测

4．3．2 肠毒素基因转录水平的检测

4．3．3 real time PCR标准曲线制作

4．3．4 不同生长阶段肠毒素基因相对表达

4．3．5 不同培养温度肠毒素基因的相对表达

4．3．6 牛奶对肠毒素基因表达的影响

4．3．7 不同种类肠毒素基因的相对表达

4．4 讨论

第五章 基于红外光谱技术金黄色葡萄球菌鉴定方法的建立

5．1 材料

5．1．1 菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 主要试剂及配置

5．1．4 仪器设备

5．2 方法

5．2．1 金黄色葡萄球菌分离株的活化

5．2．2 细菌基因组DNA的提取

5．2．3 细菌的分子鉴定

5．2．4 样品准备

5．2．5 傅里叶红外光谱谱图介绍

5．2．6 傅里叶红外光谱扫描及数据处理

5．2．7 数据可重复性分析

5．2．8 金黄色葡萄球菌的鉴定分析

5．3 结果与分析

5．3．1 不同菌株间原始谱图的比较

5．3．2 数据可重复性的计算

5．3．3 HCA模型的建立及金黄色葡萄球菌的鉴定

5．3．4 利用监督模型鉴定金黄色葡萄球菌

5．4 讨论

第六章 结论与展望

6．1 主要结论

6．2 特色和创新

6．3 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间已发表和准备中的学术论文