大西洋Cadiz湾泥火山富集样品中N5,N10-亚甲基四氢甲烷喋呤还原酶(Mer)来源的初步研究

摘要

甲烷是大气中含量最为丰富的碳氢化合物,是引起全球变暖的主要温室气体之一。在占地球面积71％的海洋里,厌氧甲烷氧化作用消耗了超过90%海洋年甲烷释放量。研究海洋深部生物圈微生物参与的厌氧甲烷氧化过程不仅能深入探究碳的生物循环在地球碳循环中的重要意义,还能了解海洋对全球气候变暖的作用。因此,微生物尤其是厌氧甲烷氧化古菌(ANME)参与的厌氧甲烷氧化作用成为近年来国际上的研究热点。
　　 ANME参与的厌氧甲烷氧化作用通常与硫酸盐还原作用偶联。目前己报道ANME中厌氧甲烷氧化途径的研究结果主要基于宏基因组测序,并推测厌氧甲烷氧化途径是产甲烷途径的逆过程。尽管已从核酸水平证明ANME中含有除Mer蛋白外参与厌氧甲烷氧化途径的全部酶,但既未找到Mer蛋白存在的证据,又无充足证据证明该步骤被其它分支途径取代。本实验室前期对大西洋Cadiz湾泥火山(冷泉)样品富集物的宏基因组测序结果中发现存在两类Mer蛋白编码基因mer-1和met-2:16S rRNA文库测序结果表明该样品古菌仅有ANME-2a和MBGD(Marine Bemhic Group D)两个类群,且ANME-2a占优势。因此,推测mer基因很可能来自于占优势的ANME-2a类群。基于以上研究结果构建mer基因系统进化树,发现mer-2基因位于产甲烷古菌分支,推测可能来源于ANME-2a类群。因此,本研究通过一系列实验方法对mer-2基因的来源进行初步研究,并对克隆得到的mer-2基因及其上下游基因进行分析。
　　 本研究先对冷泉富集物样品进行HF处理、超声波处理、HC1和紫外处理,从沉积物颗粒中分离微生物细胞并降低背景荧光强度对荧光显微镜镜检和流式细胞分选过程的干扰:然后利用FISH方法将ANME-2a古菌与荧光标记的特异性核酸探针杂交,获得带有荧光标记的阳性ANME-2a细胞:再通过流式细胞仪分选带有荧光标记的ANME-2a细胞;最后设计mer-2基因特异性引物通过PCR方法ANME-2a细胞中克隆该基因。实验结果表明,经过物理/化学方法处理后,样品的背景颗粒物自发荧光强度明显下降,且镜检未发现细胞团。为确定分选效率,将弧菌与FISH杂交的大肠杆菌以不同比例混合,流式细胞分选并对分选结果镜检计数,确定