大西洋cadiz海湾泥火山样品甲烷氧化富集微生物群落以及珠江口沉积物甲烷氧化研究

摘要

本文运用转录组和宏基因组作为技术手段，研究采用以甲烷作为唯一能源或有机碳源，硫酸盐作为唯一电子受体，经高压连续培养一年的大西洋Cadiz海湾泥火山样品。通过对富集产物的微生物群落、代谢途径、基因转录表达水平等方面的研究，推断相关微生物在厌氧甲烷氧化和硫酸盐还原中的功能和相应的代谢途径，以及可能参与的地球化学循环过程。同时也通过基于RNA的分子生物学手段调查研究珠江口甲烷渗漏区的古菌群落，推测参与珠江口沉积物厌氧甲烷氧化的相关古菌类群。
　　 宏基因组研究是通过提取大西洋Cadiz海湾泥火山样品甲烷氧化富集微生物群落的DNA以及454测序实现的，总共测序量218 MB。转录组是提取大西洋Cadiz海湾泥火山样品的厌氧甲烷氧化富集微生物群落的mRNA，以及Illumina测序实现的，共得到2.3 G的数据。宏基因组研究发现古菌主要由ANME-2a和MBGD组成，此外还有少量的甲烷产生菌，ANME-2a占到了82％，是绝对的主要古菌微生物类群。无论是来源于16S rRNA基因克隆文库的细菌多样性，还是来源于宏基因组的16S rRNA数据，都得到了丰富的细菌类群，说明参与厌氧甲烷氧化过程细菌的多样性和复杂性。最主要的细菌类群是Gammaproteobacteria，在宏基因组数据中占到56％，而在16S rRNA文库中为42％。通过转录组蛋白分类分析，得到与甲烷产生菌和硫酸盐还原菌相关的蛋白是高表达的，与其它种类的微生物类群相关的蛋白也是表达的，只不过所占的比例较少，低于总蛋白的10％。
　　 大西洋Cadiz海湾泥火山样品甲烷氧化富集微生物群落中负责甲烷氧化的古菌是ANME-2a，并发现了完整的甲烷产生途径，发现了ANME-1中所缺乏的mer基因。同时也发现了完整的硫酸盐还原途径。通过转录组研究，发现甲烷氧化途径和硫酸盐还原途径的关键酶基因是高表达的，说明甲烷氧化就是甲烷产生的逆反应。但是没有发现二条代谢途径相连接的中间电子传递物。转录组结果也显示，甲基氧化关键酶mxaF的表达，推测大西洋Cadiz海湾泥火山样品甲烷氧化富集微生物群落中Gammaproteobacteria细菌的作用是参与甲烷氧化所产生的甲基的氧化过程。在对甲烷产生途径关键酶的进化分析中发现，甲烷氧化菌的起源是多样化的。其中ANME-2和ANME-3是起源于Methanosarcinales，ANME-1在进化上更古老，与现有的甲烷产生菌亲缘关系较远，结果很好地解释了在ANME-1中mer基因的缺失原因，可能采用与现有甲烷产生菌不同的代谢通路。由此推测，可能现有的甲烷产生菌和甲烷氧化菌都是起源于更加古老的甲烷产生菌祖先，甲烷产生过程可能早于甲烷氧化过程。
　　 对珠江口沉积物中厌氧氧化区域，通过沉积物RNA的提取和反转录，研究珠江口古菌的16S rRNA多样性。结果显示，古菌主要组成部分是不可培养的，以往在沉积物中发现的C3，MBGB，MGI，MCG，TMEG，MBGD，ANME-1，ANME-2 and VALⅢ古菌类群，在珠江口沉积物中是有活性，其RNA是表达的。负责甲烷氧化的古菌是ANME-1，ANME-2，但是即使在SMTZ区域，含量都少于16S rRNA文库的10％，说明此区域的主要代谢过程并不是甲烷氧化。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1 海洋微生物研究进展

1．1 海洋生态环境

1．2 海洋微生物特性

1．3 海洋微生物的种类及其分布

2 微生物在海洋地化循环中的作用

2．1 海洋微生物在硫循环中的作用

2．2 海洋微生物在碳循环中的作用

2．3 海洋微生物在氮循环中的作用

3 微生物分子生态研究方法

3．1 分子生态学研究的相关技术

3．2 基于PCR的方法分析微生物群落结构

3．3 微生物定量技术

3．4 同位素示踪技术和生物标志化合物的研究

3．5 原位微生物生态学技术

4 本论文的研究对象

4．1 冷泉生态系统

4．2 珠江口生态系统

4．3 厌氧甲烷氧化过程

5 本论文研究内容、目的和意义

第2章 厌氧甲烷氧化富集物的宏基因组和转录组测序

1 引言

2 材料

2．1 设备

2．2 样品

3 方法

3．1 454测序样品DNA的提取(小量抽提法)

3．2 粗提DNA的纯化

3．3 测序样品的制备

3．4 沉积物RNA提取方法(omega试剂盒方法)

3．5 粗提总RNA的16S rRNA的去除(mRNA-ONLY kit，Epicentre)

3．6 mRNA的扩征

3．7 454测序过程

3．8 Illumina测序过程

3．9 序列拼接

3．10 基因注释

4 结果与讨论

4．1 DNA提取和mRNA提取结果

4．2 厌氧甲烷氧化富集物的宏基因组和转录组测序

4．3 454与Illumina测序技术的长处及短处

4．4 本研究样品和方法技术方面的研究优势

第3章 厌氧甲烷氧化富集产物微生物群落组成

1 引言

2 材料及方法

2．1 古菌和细菌16S rRNA基因的克隆

2．2 宏基因组数据和转录组数据的微生物群落多样性分析

3 结果与分析

3．1 厌氧甲烷氧化富集微生物群落分类单元

3．2 厌氧甲烷氧化富集微生物群落域水平的分类单元

3．3 甲烷氧化富集产物的基于16S rRNA的古菌多样性

3．4 甲烷氧化富集产物的基于16S rRNA的细菌多样性

3．5 甲烷氧化富集产物基于16S rRNA的属水平的微生物多样性

3．6 甲烷氧化富集产物基于蛋白的宏基因组和转录组微生物多样性

4 讨论

4．1 厌氧甲烷古菌多样性

4．2 硫酸盐还原细菌

4．3 宏基因组数据和转录组数据根据蛋白得到的微生物群落多样性差异分析

4．4 宏基因组数据基于蛋白和16S rRNA微生物群落多样性差异分析

4．5 厌氧甲烷富集培养物中的细菌

第4章 甲烷氧化富集物的微生物代谢特征

1 引言

2 方法

2．1 基因组或转录组注释

2．2 关键基因查询

2．3 进化树的构建

3 结果与分析

3．1 基因组的Ipath分析

3．2 甲烷富集微生物群落宏基因组与转录组对比

3．3 厌氧甲烷氧化古菌代谢途径

3．4 甲烷代谢途径关键基因的进化分析

3．5 硫酸盐代谢途径分析

3．6 氮代谢途径分析

3．7 好氧甲烷氧化途径分析

3．8 代谢关键基因的转录组分析

4 讨论

4．1 厌氧氧化途径

4．2 厌氧氧化的其它途径

第5章 珠江口淇澳岛海岸带沉积物甲烷代谢与古菌生物群落分析

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 基本方法

3 结果与分析

3．1 珠江口沉积物甲烷、硫酸盐含量垂直分布情况

3．2 珠江口沉积物古菌多样性及分布情况

4 讨论

4．1 不可培养古菌

4．2 甲烷氧化与甲烷产生

参考文献

致谢