MiR-517a和MiR-517c在肝癌中的作用研究

摘要

MiRNAs是一类可以负性调控基因表达的小的非编码RNA。越来越多的研究表明，一些miRNAs在肿瘤发生中起到类似肿瘤抑癌基因的作用，而这一作用与肿瘤中表观遗传学机制异常有密切的关系。为了在肝细胞癌中寻找和鉴定具有类似功能的miRNAs，我们首先联合应用两种抗肿瘤药物5-氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2'deoxycytidine，DAC)和曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)分别处理八个肝细胞癌细胞株:YY8103, HepG2, MHCC97-H, MHCC97-L, Hep3B, Huh7, SK-hep-1和FOCUS，分析了处理前后人类723个miRNAs的表达变化。结果发现，19号染色体上的一个最大的miRNA cluster(C19MC)的表达水平在部分细胞株中明显升高。该区域位于19q13.41，包含43个miRNA，通过对43个miRNA的细胞活力筛选试验表明，过表达miR-517a和miR-517c可以抑制部分肝癌细胞的生长和增殖，使细胞周期停滞在G2/M期。另一方面，MiR-517a和MiR-517c的表达下调可以促进HepG2，MHCC97-H,MHCC97-L细胞的贴壁非依赖性软琼脂克隆形成能力。我们还应用荧光素酶报告基因实验验证了生物信息学方法对miR-517a和miR-517c靶基因的分析，结果表明，Pyk2是miR-517a和miR-517c的一个直接作用调控的靶基因。结合miR-517a和miR-517c在肝细胞癌中的表达下调的情况，我们得出以下结论:下调miR-517a和miR-517c的表达水平可以促进肝癌细胞的生长，而这一过程可能是由Pyk2介导完成的。

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摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 肝癌简介

1．2 肝癌发生的分子机制

1．3 miRNA发生与功能

1．4 C19MC研究进展

1．4．1 正常表达和调控

1．4．2 肿瘤中异常表达和调控

1．4．3 肿瘤中的功能研究

1．4．4 总结

1．5 研究目的

第二章 表观遗传学机制对C19MC的影响

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．2．3 Stem-loop RT-PCR引物

2．2．4 细胞培养

2．2．5 药物处理

2．2．6 总RNA抽提

2．2．7 芯片检测(Agilent human miRNA microarray(V2))

2．2．8 miRNA抽提

2．2．9 Stem-loop RT-PCR

2．2．10 统计学分析

2．3 结果

2．3．1 去甲基化药物可以影响肝癌细胞株中miRNA的表达

2．3．2 C19MC上miRNA受甲基化调控

2．3．3 miRNA特异RT-PCR验证芯片结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 miR-517a和miR-517c对肝癌细胞增殖能力的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 化学合成miRNA mimics和miRNA inhibitor

3．2．2 质粒构建

3．2．3 细胞转染

3．2．4 抑癌基因筛选方法

3．2．5 细胞生长曲线的测定

3．2．6 细胞克隆形成实验

3．2．7 软琼脂克隆形成实验(以24孔板为例)

3．2．8 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 miR-517a和miR-517c过表达对肝癌细胞YY8103的生长具有抑制作用

3．3．2 miR-517a和miR-517c过表达抑制其他肝癌细胞的生长

3．3．3 miR-517a和miR-517c过表达可以抑制肝癌细胞的克隆形成能力

3．3．4 miR-517a和miR-517c表达下调可以促进肝癌细胞的生长

3．3．5 miR-517a和miR517c表达下调可以促进肝癌细胞的平板克隆形成能力

3．3．6 miR-517a和miR-517c表达下调可以促进肝癌细胞的贴壁非依赖性生长

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 miR-517a和miR-517c对肝癌细胞周期的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 细胞同步化

4．2．2 流式细胞术分析细胞周期

4．2．3 细胞凋亡检测

4．2．4 统计学分析

4．3 结果

4．3．1 miR-517a和miR-517c过表达引起肝癌细胞在G2／M期阻滞

4．3．2 miR-517a和miR-517c 过表达引起肝癌细胞凋亡

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 miR-517a和miR-517c的靶基因寻找与鉴定

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 靶基因预测分析软件

5．2．2 萤光素酶报告基因实验

5．2．3 总RNA抽提

5．2．4 RT-PCR

5．2．5 统计学分析

5．3 结果

5．3．1 生物信息学方法预测的miRNA靶基因

5．3．2 细胞周期相关靶基因

5．3．3 Pyk2是miR-517a和miR-517c的一个潜在靶基因

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 miR-517a和miR517c组织表达谱

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 肝癌及癌旁组织来源

6．2．2 miRNA抽提

6．2．3 stem-loop RT-PCR

6．2．4 统计学分析

6．3 结果

6．3．1 miR-517a和miR-517c在肝癌样本中的表达谱

6．4 讨论

6．5 小结

总结

参考文献

致谢

攻读学位期间完成的学术论文