SIRT1/2调节血管平滑肌细胞分化与细胞外基质表达的力学生物学机制初探

摘要

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管壁主要细胞成分之一，它由收缩表型向合成表型去分化（dedifferentiation）是血管重建（remodeling）发生发展过程中的重要事件。VSMCs的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成参与调控细胞增殖和迁移，对维持血管壁弹性和功能稳定具有重要作用。血液动力学因素和生长因子是引起 VSMCs表型转化和细胞外基质合成的重要因素。在体 VSMCs主要受到脉动血流产生的机械张应力的作用，转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）是调控VSMCs表型转化和ECM合成的重要生长因子之一。研究周期性张应变和TGF-β1对VSMCs分化和ECM的影响及其机制，对于探讨血管重建机制有重要的意义。
　　本文应用FX-4000T细胞张应变加载系统，对体外培养的大鼠VSMCs施加10％周期性张应变，频率为1.25Hz，加载时间为24h，以未加载张应变的静态VSMCs为对照组。采用Western blotting检测组蛋白去乙酰化酶 SIRT1和SIRT2以及收缩表型标志分子α-肌动蛋白（α-actin）、调宁蛋白（calponin）和肌动蛋白相关蛋白（SM22α）蛋白水平的变化；抑制剂Salermide抑制SIRT1和SIRT2表达，基因芯片筛查Salermide干预下周期性张应变加载VSMCs的差异表达基因，以研究SIRT1和SIRT2在生理范围周期性张应变对VSMCs表型分化中的影响及其分子机制。使用10ng/mL浓度的TGF-β1重组蛋白对体外培养的VSMCs刺激24 h，以未加刺激的VSMCs为对照组，采用Western blotting检测SIRT1、SIRT2，收缩表型标志分子calponin、SM22α，ECM collagen I、elastin、collagen III蛋白水平的变化；抑制剂 Salermide或 siRNA干扰抑制 SIRT1和SIRT2表达，以研究SIRT1和SIRT2在TGF-β1对VSMCs表型分化和细胞基质合成中的影响及其分子机制。
　　结果显示：①施加10%-1.25Hz周期性张应变诱导VSMCs收缩表型标志分子α-actin、calponin和SM22α的表达增加；②周期性张应变诱导SIRT1和SIRT2的蛋白表达增加；③SIRT1和SIRT2抑制剂 Salermide抑制周期性张应变诱导的SIRT1和SIRT2的表达，同时显著抑制 VSMCs收缩表型标志分子的表达；④基因芯片筛选121个差异表达基因，可能受 SIRT1和SIRT2调控，参与包括分化在内的多种生物过程。⑤10ng/mL浓度的TGF-β1重组蛋白刺激24 h，诱导VSMCs收缩表型标志分子calponin、SM22α和ECM collagen I、elastin、collagen III的表达上升；⑥ TGF-β1诱导SIRT1和SIRT2的蛋白表达增加；⑦ Salermide抑制TGF-β1诱导的SIRT1和SIRT2的表达，同时显著抑制 VSMCs收缩表型标志分子calponin、SM22α和ECM collagen I、elastin的表达，但是对collagen III无显著影响；⑧ SIRT1和SIRT2的siRNA干扰抑制TGF-β1诱导的SIRT1和SIRT2表达，显著抑制 VSMCs收缩表型标志分子calponin、SM22α的表达。⑨ Salermide抑制TGF-β1诱导的Smad5、Akt、ERK磷酸化，但是对CTGF无影响。
　　上述结果表明，周期性张应变和TGF-β1可诱导体外培养的合成型VSMCs分化为收缩表型，TGF-β1可诱导VSMCs ECM collagen I和elastin合成，其机制都与SIRT1和SIRT2信号通路相关。结果提示，在体情况下血管正常范围的张应变以及 TGF-β1刺激，能防止VSMCs由收缩表型向合成表型去分化，促进ECM合成，维持血管结构和功能的稳定。

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英文缩略语

第1章 SIRT1/2 在周期性张应变诱导血管平滑肌细胞表型分化中的作用及其机制

1.1 引言

1.1.1 VSMCs 表型分化的影响因素及调控机制

1.1.2 SIRT1/2 蛋白的生物学功能及其研究现状

1.1.3 本研究的主要内容和意义

1.2 实验材料及仪器

1.2.1 实验仪器

1.2.2 试剂

1.2.3 主要溶液成分及配制

1.3 实验方法

1.3.1 原代 VSMCs 培养

1.3.2 α-actin 免疫细胞化学实验

1.3.3 细胞张应变加载系统

1.3.4 实验分组

1.3.5 蛋白提取

1.3.6 蛋白免疫印迹检测

1.3.7 加药处理实验

1.3.8 RNA 的提取（TRIzol 法）

1.3.9 基因芯片实验

1.3.10 统计学方法

1.4 实验结果

1.4.1 周期性张应变促进 VSMCs 表型分化

1.4.2 周期性张应变诱导 VSMCs 的SIRT1 与SIRT2 表达

1.4.3 Salermide 抑制张应变诱导的VSMCs 表型转化

1.4.4 Salermide 抑制张应变诱导的VSMCs 表型转化机制研究

1.5 讨论

第2章 SIRT1/2 在转化生长因子-β1 调控的血管平滑肌细胞表型分化和细胞外基质表达中的作用及其机制

2.1 引言

2.1.1 TGF-β1调控VSMCs 表型转化

2.1.2 TGF-β1调控VSMCs 细胞外基质

2.1.3 本研究的主要内容和意义

2.2 实验材料及仪器

2.2.1 实验仪器

2.2.2 试剂

2.2.3 主要溶液成分及配制

2.3 实验方法

2.3.1 实验分组

2.3.2 RNA 干扰实验

2.3.3 加药处理实验

2.3.4 蛋白免疫印迹检测

2.4 结 果

2.4.1 TGF-β1 促进VSMCs的收缩型分化标志表达

2.4.2 TGF-β1促进VSMCs的SIRT1 和SIRT2表达

2.4.3 Salermide 抑制TGF-β1 诱导的VSMCs 表型转化

2.4.4 SIRT1 和SIRT2 RNA 干扰抑制TGF-β1 诱导的VSMCs 表型转化

2.4.5 Salermide 调节TGF-β1 诱导的VSMCs ECM 变化

2.5 讨论

全文小结

参考文献

致谢

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