细胞骨架蛋白Mena和整合素α9在肝细胞癌转移中的作用及机制研究

摘要

本课题分为两部分，涉及两个在肝细胞癌（以下简称肝癌）中尚未研究的基因，哺乳动物 ENA(Mammalian enabled homolog，MENA)和整合素α9（Integrinα9，ITGA9），分别对它们在肝癌转移中的功能和相关机制进行研究。
　　第一部分、探讨微丝调节蛋白Mena在肝癌转移中的作用。目前细胞骨架相关蛋白在肿瘤发生发展中作用机制的研究主要是微管及其相关蛋白，而微丝系统在肿瘤学领域的研究还处于早期阶段。我们通过体内和体外实验观察了微丝调节蛋白Mena在肝癌细胞转移中的作用，并对相关信号通路进行了初步探索。首先，我们通过Real-time PCR与组织芯片技术检测了MENA在肝癌细胞和组织中的表达，研究结果表明，肿瘤组织芯片中Mena蛋白表达与癌栓形成、肿瘤多样性、微血管侵袭和肝癌TNM分期正相关；通过慢病毒感染的方法得到MENA干扰肝癌细胞株，并对它们进行了迁移、侵袭、凋亡、细胞免疫荧光等一系列细胞生物学实验，在细胞水平观察MENA对肝癌侵袭转移的影响及分子机制,结果显示MENA干扰能抑制肝癌细胞迁移和侵袭，促进其发生失巢凋亡，促进细胞骨架合成以及黏着斑和伪足的形成；进一步通过Western Blotting实验、Pull Down实验和表达谱芯片技术观察了MENA干扰肝癌细胞株在蛋白质水平、磷酸化蛋白质水平和mRNA水平的变化，认为Mena对STAT3、 Erk和RhoA活性的上调及Cdc42活性的下调可以部分的解释MENA对肝癌细胞生存、迁移及侵袭的促进作用；最后进行了体内实验，结果在裸鼠的肝原位和尾静脉肿瘤移植模型中，MENA都表现出对肝癌细胞在体内转移的促进作用。由此，我们不但通过组织芯片发现MENA表达与肝癌转移的指标正相关，而且在细胞、分子以及体内水平研究了MENA如何促进肝癌转移以及相关的机理，为进一步探索MENA及微丝系统对肝癌转移的影响提供了依据。
　　第二部分、主要研究整合素α9（Integrinα9，ITGA9）在肝癌发展转移中的作用。整合素是一类细胞表面的糖蛋白受体，该家族介导机械信号与生化分子信号之间的转化，与肿瘤细胞在肿瘤微环境中的黏附和运动密切相关，同时也对细胞骨架起调节作用。通过细胞增殖、侵袭和失巢凋亡实验，我们发现ITGA9过表达后能够抑制肝癌细胞增殖和侵袭，促进肝癌细胞失巢凋亡。在此基础上，我们用裸鼠皮下、肝原位和尾静脉肿瘤移植模型验证了ITGA9能抑制肝癌细胞成瘤和生长，抑制在原发灶附近的转移以及在远端的转移。为了进一步研究相关分子机制，我们通过酵母双杂交技术筛选到与ITGA9相互作用的蛋白RanBP9，并在人肝形状细胞LX-2中验证了ITGA9胞内段与RanBP9的相互作用。
　　综上所述，我们通过体内外实验，证实了ITGA9具有抑制肝癌转移的功能，同时筛选并验证了与之相互作用的蛋白RanBP9，为深入研究ITGA9抑制肝癌发展转移的分子机制打下了基础。

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缩略词表

第一部分细胞骨架蛋白Mena在肝癌转移中的作用及机制研究

前言

第一章 Mena肝癌组织芯片免疫组化及临床统计学分析

第二章 肝癌细胞MENA干扰株建立及MENA对细胞生物学功能的影响

第三章 Mena参与的信号通路初探

第四章 裸鼠肿瘤移植实验

总结与讨论

第二部分整合素α 9在肝癌发展中作用的初步研究

前言

第一章 ITGA9肝癌细胞过表达株构建及ITGA9功能研究

第二章 ITGA9肝癌细胞过表达株裸鼠肿瘤移植模型验证ITGA9促癌作用

第三章 酵母双杂交筛选与ITGA9相互作用蛋白以及Co-IP验证ITGA9与RanBP9的相互作用

总结与讨论

综述一: Ena-VASP家族蛋白及其在肿瘤学研究的概况

综述二: 整合素家族与整合素α9β 1研究进展

参考文献

附录一

附录二

附录三

附表

在学期间发表的学术论文

致谢